Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Entwicklung eines Nucleic Acid Lateral Flow Immunoassays (NALFIA) zur Detektion der Methicillin-Resistenzgene mecA und mecC bei Staphylococcus aureus

Ernst, Constanze

Molekulare Methoden bieten einen schnellen, sicheren und kostengünstigen Nachweis von methicillinresistenten Staphylococcus aureus (MRSA). Diese sind jedoch abhängig von einer Extraktion qualitativ hochwertiger bakterieller DNA. Erstes Ziel der hier vorgestellten Studie war es daher, ein optimiertes DNA-Extraktions- und Aufreinigungsprotokoll für MRSA mit magnetischen Nanopartikeln mit der Originalmethode von Hodgson (2014) zu vergleichen. Hierfür wurde die Reinheit der extrahierten DNA durch photometrische Messungen ermittelt und die DNA Menge durch eine Real-time-PCR bestimmt. Verwendet wurden dafür drei MRSA-Referenzstämme (S. aureus ATCC® 70699, S. aureus ATCC® 43300; S. aureus ATCC® 33592) und elf MRSA-Feldstämme, die SCCmec-Elemente der Typen I bis XI beinhalteten. Im Vergleich zu der ursprünglichen Methode spart die Extraktion mit dem optimierten Protokoll ca. 20 min Zeit und bietet zudem auch eine höhere DNA-Ausbeute. Das zweite Ziel der vorliegenden Dissertation war es, eine schnelle und verlässliche Nachweismethode für die Methicillin-Resistenzgene mecA und mecC auf Basis der Nucleic Acid Lateral Flow Immunoassay (NALFIA)-Technologie zu entwickeln. Bei diesem Verfahren werden die Zielsequenzen amplifiziert, über eine Antigen-Antikörper-Interaktion auf einer Nitrozellulosemembran immobilisiert und durch Kohlenstoffpartikel visualisiert. Um den PCR-NALFIA-Assay zu evaluieren wurde ein Screening von 60 definierten Stämmen (34 methicillinresistente Staphylokokken und 26 andere Bakterien) und 28 MRSA-Isolaten aus klinischen Proben durchgeführt. PCR-NALFIA detektiert und separiert zuverlässig die Resistenzgene mecA und mecC. Zusätzlich bietet das Verfahren, im Vergleich zu PCR mit anschließender Gelelektrophorese und Real-time-PCR, Vorteile in Bezug auf die Nachweisgrenzen. PCR-NALFIA bietet so eine einfach zu handhabende Methode und benötigt nur einen Bruchteil der Zeit, die für einen kulturellen MRSA-Nachweis erforderlich ist.

Molecular methods offer fast, reliable and cost-efficient detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). However, these tests depend on a rapid extraction of pure bacterial DNA. The first aim of the present study was to compare an optimized protocol for DNA extraction and purification using magnetic nanoparticles with the original method (Hodgson, 2014). The purity of the extracted DNA was assessed by photometric measurements and the DNA quantity was determined by real-time-PCR. Three MRSA reference strains (S. aureus ATCC® 70699, S. aureus ATCC® 43300; S. aureus ATCC® 33592) and eleven MRSA field strains carrying SCCmec elements of types I to XI were used. The optimized protocol can save approximately 20 min time and resulted in higher DNA yields. The second aim of this dissertation was to develop a rapid and reliable detection method for the methicillin resistance genes mecA and mecC based on nucleic acid lateral flow immunoassay (NALFIA) technology. In PCR-NALFIA, the target sequences are amplified by PCR, immobilized via antigen-antibody interaction and finally visualized by carbon particles. To evaluate the PCR-NALFIA assay, 60 defined strains (34 methicillin-resistant staphylococci and 26 non-target bacteria) and 28 MRSA isolates from clinical samples were investigated. The resistance genes mecA and mecC could be detected and differentiated reliably by PCR-NALFIA. Comparative experiments with PCR followed by gel electrophoresis (PCR-GE) and real-time-PCR exhibited advantages of PCR-NALFIA regarding the detection limits. PCR-NALFIA is easy to handle and needs considerably less time than cultural methods for MRSA detection.

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Ernst, Constanze: Entwicklung eines Nucleic Acid Lateral Flow Immunoassays (NALFIA) zur Detektion der Methicillin-Resistenzgene mecA und mecC bei Staphylococcus aureus. Hannover 2019. Tierärztliche Hochschule Hannover.

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