Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Equine Metabolic Syndrome : (Patho-)physiological variations in insulin sensitivity, glucose homeostasis and lipid metabolism in lean and obese horses

Warnken, Tobias

Das Equine Metabolische Syndrom (EMS) ist eine bedeutende Endokrinopathie der Equiden. Erkrankte Pferde zeigen neben einer generalisierten Obesitas oder regionalen Adipositas mit Ausbildung krankheitstypischer Fettdepots im Bereich der Kruppe, der Schultern, der seitlichen Thoraxwand und des Halses, eine erhöhte Prädisposition für Hufrehe sowie Veränderungen in der Insulinregulation (Frank et al. 2010, Frank and Tadros 2014). Heutzutage ist die Obesitasprävalenz in der Pferdepopulation hoch (Wyse et al. 2008, Giles et al. 2014) und die Inzidenz der endokrinopathischen Hufrehe nimmt zu (Karikoski et al. 2011). Sowohl bei Tierärzten als auch bei Tierbesitzern steigt das Bewusstsein für einen Zusammenhang zwischen Hyperinsulinämie (HI) und Hufrehe. Daher steigen Besitzeranfragen zur Abklärungen einer EMS Erkrankung ihrer Pferde in der letzten Zeit an. In der Praxis kann eine gestörte Insulinregulation auf verschiedene Weise erfasst werden. Neben der Bestimmung einer basalen HI können auch dynamische Diagnostiktest angewendet werden um eine Insulinresistenz (IR) oder eine Insulindysregulation (ID) zu diagnostizieren (Bertin and De Laat 2017). Ziel des PhD Projektes war es die physiologischen und pathophysiologischen Variationen der Insulinsensitivität, der Glukosehomöostase und des Fettstoffwechsels in schlanken und obesen Pferden auf Grundlage von klinischen Parametern sowie auf molekularer Ebene zu untersuchen. Im ersten Teil dieses Forschungsprojektes wurden aufeinanderfolgend ein oraler Glukose Test (OGT) und ein kombinierter Glukose-Insulin Test (CGIT) in schlanken und obesen Pferden durchgeführt, um die endokrinologischen und metabolischen Reaktionen zu vergleichen. Im OGT zeigten die Pferde deutliche individuelle Unterschiede in der Insulinkonzentration nach enteraler Absorption der mittels Nasenschlundsonde verabreichten Glukose. Im Gegensatz zu den Insulinkonzentrationen zeigten die Pferde vergleichbare Glukosekonzentrationen. Im CGIT konnten initiale Peak Insulinkonzentrationen von 493,98 ± 86,84 µIU/ml gemessen werden; gefolgt von einem kontinuierlichen Abfall. Interessanterweise zeigten die basalen Konzentrationen an nicht-veresterten freien Fettsäuren (NEFA) eine hohe individuelle Schwankung zwischen den einzelnen Pferden. Im weiteren Verlauf der beiden Stimulationstests zeigte sich jedoch ein vergleichbarer Abfall der NEFA Konzentrationen bis hin zu vergleichbaren Minimalkonzentrationen im OGT von 93,82 ± 53,22 µmol/l und 91,97 ± 56,89 µmol/l im CGIT. Während im CGIT kein stressinduzierter Kortisolanstieg zu beobachten war, zeigten die Pferde im OGT einen signifikanten, initialen Anstieg im Serumkortisolgehalt. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass OGT und CGIT unterschiedliche Facetten einer metabolischen Antwort auf einen glykämischen Stimulus reflektieren. Die beiden Tests erfassen unterschiedliche Aspekte der Glukosehomöostase und der Insulinregulation und erlauben aufgrund Ihrer zugrundeliegenden Stimulationsmechanismen differenzierte Aussagen in Bezug auf IR und ID und eigenen sich für unterschiedliche klinische Fragestellungen. Es zeigte sich eine verzögerte Insulinkinetik bei der Durchführung des CGIT mit porzinem Zink Insulin im Vergleich zu den bisher eingesetzten sofortwirksamen Insulinanaloga. Diese Unterschiede können zum einen einen klinischen Vorteil darstellen und das Risiko einer testinduzierten Hypoglykämie reduzieren, erlauben jedoch zum anderen bisher keinen routinemäßigen Einsatz in der Pferdepraxis, da für das verzögert wirksame Zink Insulin noch keine verlässlichen Referenzwerte etabliert sind. Im zweiten Teil der Studie wurde die Expression und Phosphorylierung mehrerer in der Insulinsignalkaskade relevanter Proteine unter basalen und stimulierten, hyperinsulinämischen und hyperglykämischen Bedingungen in unterschiedlichen Geweben dünner und adipöser Pferde untersucht. Alle Pferde zeigten eine deutliche Zunahme der Phosphorylierung des Insulinrezeptors-β (InsR- β) im Lebergewebe unter der Stimulation mit Insulin. Im Muskelgewebe zeigte sich jedoch keine Zunahme der Phosphorylierung des InsR-β. Protein Kinase B (PKB/AKT) und mechanistic Target of Rapamycin (mTOR) zeigten in allen untersuchten Geweben eine Zunahme der Phosphorylierung unter der Stimulation. Im Gegensatz dazu zeigte die AMP-aktivierte Proteinkinase α (AMPK-α), ein Protein, das mit der Insulinsignalkaskade in Verbindung steht, eine gesteigerte Phosphorylierung im Muskel- und Fettgewebe. Im Lebergewebe jedoch fand sich keine Veränderung im Phyosphorylierungsgrad dieses Proteins zwischen basalen und stimulierten Bedingungen. Zusammenfassend konnten nach intravenöser Stimulation mittels Insulin gewebeabhängige Unterschiede in der Phosphorylierung verschiedener Proteine der Insulinsignalkaskade festgestellt werden. Insulinsensitivität in gesunden Pferden ist das Ergebnis einer komplexen Signaltransduktion in verschiedenen Geweben. Im Rahmen dieser Studie zeigten sich zudem im Pferdegewebe Hinweise auf partielle Unterschiede in der Insulin- und Glukosehomöostase im Vergleich zu Menschen und Nagern. Im dritten Teil dieser Forschungsarbeit wurden die OGT induzierten metabolischen Reaktionen verschiedener Pferde und Ponies mit unbekanntem Insulinsensitivitätsstatus untersucht. Die Ergebnisse dieses Studienteils zeigten wie erwartet signifikant höhere Seruminsulinkonzentrationen in ID Pferden und Ponies im Vergleich zu den IS Tieren. Die Untersuchungen der Blutproben mittels zielgerichteter Metabolomanalyse ergab, dass 22 Metabolite durch die orale Glukosestimulation im OGT beeinflusst werden, wohingegen die restlichen analysierten Metabolite (n=163) keine signifikanten Veränderungen unter der OGT Stimulation zeigten. Der Insulinstatus der Tiere hatte dabei keinen direkten Einfluss auf das metabolische Profil der Tiere während des OGTs. Es zeigte sich jedoch, dass die kurzzeitige Stimulation mit einer oralen Glukosestimulation, wie sie im OGT vorgenommen wird, bereits ausreicht, um im Organismus einen proinflammatorischen Zustand hervorzurufen, unabhängig von IS oder ID. Interessanterweise gelang es, Pferde und Ponies, die unter einer erheblichen ID litten bereits aufgrund des basalen Metabolom-Profils zu identifizieren. Insulindysregulierte Pferde und Ponies wiesen im Vergleich zu IS Pferden und Ponies niedrigere Trans-4-hydroxyprolin- und Methioninsulfoxidkonzentrationen auf. Stoffwechselwege, die mit Trans-4-hydroxyprolin und Methioninsulfoxid assoziiert sind, lassen vermuten, dass oxidativer Stress und ein Ungleichgewicht zwischen oxidativen und antioxidativen Stoffwechselvorgängen relevante Faktoren im Zusammenhang mit equiner ID sein können. Die zugrundeliegenden Ergebnisse liefern neue Hypothesen für folgende Forschungsarbeiten und tragen dazu bei, die Pathomechanismen der equinen ID zu entschlüsseln.

The Equine Metabolic Syndrome (EMS) is a severe endocrinopathy in equids. Alterations in insulin regulation in affected horses together with predisposition to laminitis and general or regional obesity are the leading laboratory findings (Frank et al. 2010, Frank and Tadros 2014). The obesity prevalence is generally high in the equine population (Wyse et al. 2008, Giles et al. 2014) and the incidence of endocrinopathic laminitis is emerging (Johnson et al. 2004, Karikoski et al. 2011). Veterinarian` and owners` awareness of the potential cross-link between hyperinsulinaemia (HI) and laminitis has been increasing recently. Therefore, owners` requests for EMS testing has increased. In practice, testing for impaired insulin regulation can be based on either assessment of basal HI, or dynamic diagnostic tests for insulin resistance (IR) or insulin dysregulation (ID) (Bertin and De Laat 2017). However, little is known about the underlying pathomechanisms of EMS and impaired insulin regulation. The objective of this PhD project was to investigate physiological and pathophysiological variations in insulin sensitivity, glucose homeostasis and lipid metabolism in healthy lean and obese horses on a clinically recognizable and molecular level. The first part of this research project focuses on describing physiological principles during standard dosed oral glucose tests (OGT) and combined glucose-insulin tests (CGIT) which were performed consecutively in lean and obese horses to compare the endocrine and metabolic responses. In OGT, horses showed a highly individual increase of insulin concentrations in response to the glucose applied orally, whereas glucose concentrations showed similar dynamics. In the CGIT procedure, peak insulin concentrations of 493.98±86.84 µIU/mL were measured, followed by a continuous decline. Interestingly, concentrations of non-esterified fatty acids varied between individual horses prior to testing but declined in a comparable manner to similar minimum concentrations of 93.82 ± 53.22 µmol/L in OGT and 91.97 ± 56.89 µmol/L in CGIT. Regarding the stress response of the test procedure cortisol concentrations remained unaffected during CGIT, while the OGT procedure was accompanied by a significant initial rise in cortisol concentrations. Summing up, OGT and CGIT mirror different facets of the metabolic response to a glycemic stimulus, highlighting different aspects of glucose homeostasis and insulin regulation and hence, reveal different applications in clinical settings. Moreover, insulin dynamics in CGIT, performed with porcine zinc insulin, differ from insulin dynamics described in reports published previously using short-acting insulins, providing not only potential advantages by reducing the risk of test induced hypoglycemia, but also limiting clinical usage, due to missing reliable reference ranges for test implementation with long-acting porcine zinc insulin, at least at the moment. In the second part, the protein expression of key components of insulin signaling and their extent of phosphorylation were investigated in different equine tissue under basal conditions and stimulated conditions with HI and hyperglycemia provoked by intravenous injection of insulin and glucose in lean and obese horses. Injected insulin induced a high extent of phosphorylation of insulin receptor β in liver tissue but not in muscle tissue in all horses. Protein kinase B and mechanistic target of rapamycin expressed a higher extent of phosphorylation in all tissues under stimulated conditions. By contrast, adenosine monophosphate-activated protein kinase, as a component related to insulin signaling, expressed enhanced phosphorylation in muscle tissue and different adipose tissues, but not in liver tissue under stimulated conditions. In conclusion, tissue-specific variations in the acute response of insulin signaling to insulin injected intravenously were observed in horses. Insulin sensitivity in healthy horses is based on a complex concerted action of different tissues by their variations in the molecular response to insulin and we were able to identify hints which suggest that insulin and glucose homeostasis in horses is partially different to humans and rodents. The third part of this research project focused on the dynamic metabolic profiles in response to a standard dosed OGT in horses of unknown insulin status. The results indicated significantly higher insulin concentrations in horses with severe ID compared to insulin-sensitive horses. Moreover, analyses of samples with a targeted metabolomics approach revealed that 22 metabolites were affected by OGT, whereas most of the metabolites investigated (n = 163) did not show significant changes. Interestingly, the insulin status did not affect the metabolic profile during OGT. However, the short-term stimulation with oral glucose challenge resulted in metabolic and proinflammatory changes in both insulin dysregulated and insulin-sensitive horses. Interestingly, severe ID was announced even before OGT was indicated. The ID horses and ponies had lower trans-4-hydroxyproline and methioninesulfoxide concentrations compared to IS ones. Pathways associated with trans-4-hydroxyproline and methioninesulfoxide suggested that oxidative stress and impaired oxidant-antioxidant equilibrium are contributing factors to ID. The present findings provide new hypotheses for future research to understand pathophysiology in ID horses better.

Quote

Citation style:

Warnken, Tobias: Equine Metabolic Syndrome. (Patho-)physiological variations in insulin sensitivity, glucose homeostasis and lipid metabolism in lean and obese horses. Göttingen . Cuvillier.

Rights

Use and reproduction:
All rights reserved

Export