Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Die Funktionalität und Heterogenität neutrophiler Granulozyten im peripartalen Zeitraum von Kühen mit genetischer Mastitis-Resistenz/-Suszeptibilität

Eickhoff, Tordis

Polymorphkernige neutrophile Granulozyten (polymorpho-nuclear granulocytes, PMN) gelten als Haupteffektorzellen des angeborenen Immunsystems. Ihre Aufgabe besteht in der Eliminierung eindringender Pathogene sowie der Modulation von Entzündungsreaktionen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde geprüft, ob eine genetisch determinierte Variation für Mastitis-Anfälligkeit und reproduktive Fitness in der genomischen Region des Bos-taurus-Chromosom 18 (BTA18) auf einer divergenten Zahl und Funktionalität neutrophiler Granulozyten im peripartalen Zeitraum beruht. Dabei konnte festgestellt werden, dass sich genetisch Mastitis-resistente (GQ, n = 18) und Mastitis-suszeptible (kq, n = 18) Holstein-Friesian-Färsen nicht in der Anzahl von neutrophilen Granulozyten im peripheren Blut unterscheiden. Die durchflusszytometrische Bestimmung der Phagozytoseleistung mit Hilfe Fluorochrom-markierter Staphylokokken sowie der Bildungskapazität reaktiver Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) ergab, dass sich die beiden Tiergruppen auch in diesen Funktionen peripherer Neutrophiler nicht unterscheiden. Nach experimenteller Infektion von Eutervierteln der GQ- und kq-Kühe am Tag 36±1 nach der Kalbung mit den Mastitiserregern S. aureus und E. coli wiesen beide Tiergruppen ebenfalls keine Unterschiede in der Gesamtleukozytenzahl und der Zahl neutrophiler Granulozyten im peripheren Blut sowie deren Phagozytoseleistung und ROS-Bildungskapazität auf. Daraus kann geschlussfolgert werden, dass die Infektions-abhängigen Prozesse in den Eutervierteln genetisch resistenter/suszeptibler Kühe nicht zur Freisetzung endokrin wirkender Mediatoren führten, welche die Mobilisierung und die Funktion von PMN unterschiedlich beeinflussen. Nach Abschluss des Infektionsversuches (S. aureus = 96 h, E. coli = 24 h) wurden am Tag der Tötung Gewebeproben aus dem Euterparenchym der Versuchstiere gewonnen und immunhistologische Schnitte angefertigt, um zu prüfen, ob sich die genetisch determinierte Mastitis-Resistenz bzw. -Suszeptibilität in einer unterschiedlichen Rekrutierung neutrophiler Granulozyten in das Eutergewebe manifestiert. Nur nach Inokulation mit E. coli konnten mehr PMN im Euterparenchym von kq-Kühen als bei GQ-Individuen ermittelt werden. Unter Zugrundelegung der Expressionsmodulation des Epitops, welches vom verwendeten Antikörper zum Nachweis neutrophiler Granulozyten erkannt wird, deutet dieses Ergebnis darauf hin, dass die Zellvitalität rekrutierter PMN im Euter von kq-Kühen anders reguliert wird als bei GQ-Kühen. Für den bisher einzig verfügbaren spezifischen Antikörper für bovine Granulozyten mit der Bezeichnung CH138A lagen bisher keine Berichte vor, welche Zielstruktur auf der Oberfläche von PMN von diesem Antikörper erkannt werden, ebenso wenig über dessen Expressionsmodulation. Nach In-vitro-Stimulation separierter neutrophiler Granulozyten aus dem Blut nicht genetisch selektierter Kühe konnte gezeigt werden, dass absterbende (apoptotische und nekrotische) PMN das von CH138A erkannte Molekül um bis zu 40 % herunterregulieren. Diese Beobachtung untermauerte die Hypothese der heterogenen Anfärbung der Zellen in der Immunhistologie durch eine divergente Zellvitalität. Weiterhin wurde die CH138A-Zielstruktur durch den Einfluss von S. aureus in vitro massiv (um 78 %) herunterreguliert, was nach Stimulation mit E. coli nicht festgestellt werden konnte. Diesem hemmenden Einfluss auf die Expression des CH138A-Zielmoleküls standen fördernde Einflüsse chemotaktischer Signale durch Interleukin-8 (CXCL8) sowie durch den Vorgang der Migration gegenüber. CXCL8 führte zu einer Hochregulation der Zielstruktur um 10 %, nach dem Prozess der In-vitro-Migration konnte sogar ein 1,8-facher Anstieg der Zielstrukturexpression erfasst werden. Dies deckte sich mit der Expressionsmodulation anderer Zelloberflächenmoleküle auf neutrophilen Granulozyten, von denen die Moleküle CD62L, CD11b und CD172a untersucht wurden. Diese wiesen nach Kontakt der Zellen mit CXCL8 oder erfolgter In-vitro-Migration einen bis zu 1,5-fachen Anstieg der Expression (CD11b) oder eine Herabregulation um bis zu 77 % (CD62L) auf. Die In-vitro-Versuche zur Expressionsmodulation können als richtungsweisend für die tatsächliche Modulation der PMN im Organismus angesehen werden. Um herauszufinden, ob sich unter den zirkulierenden PMN der genetisch selektierten Tiere Subpopulationen von neutrophilen Granulozyten befinden, wurde versucht deren Heterogenität, analog zu Mensch, Maus und Pferd, anhand der Präsenz von neutrophilen Granulozyten geringerer Dichte (low density neutrophils, LDN) beim Rind nachzuweisen. Diese initialen Untersuchungen ergaben Hinweise auf die Existenz von bovinen low density neutrophils. Zwischen GQ- und kq-Kühen bestanden – bei erheblicher Variabilität des LDN-Anteils unter den mononukleären Zellen von unter 5 % bis weit über 5 % - keine Unterschiede. In dieser Arbeit konnte die Hypothese, dass eine unterschiedliche Mastitis-Resistenz bzw. -Suszeptibilität in der genomischen Region von BTA18 auf einer unterschiedlichen Anzahl oder Funktionalität zirkulierender neutrophiler Granulozyten beruht, nicht bestätigt werden. Immunhistologische Detailanalysen und In-vitro-Versuche zur Expressionsmodulation neutrophiler Oberflächenmoleküle deuten jedoch darauf hin, dass das Eutergewebe Mastitis-resistenter und Mastitis-suszeptibler Kühe zu einer differenziellen Modulation immigrierender neutrophiler Granulozyten in Abhängigkeit vom Pathogen führt.

Polymorphonuclear neutrophil granulocytes (PMN) are main effector cells of the innate immune system. They eliminate invading pathogens and take part in the modulation of inflammatory reactions. The aim of this project was to examine whether a genetically determined variation for mastitis susceptibility and reproductive fitness in a specific genomic region on Bos taurus chromosome 18 (BTA18) is based on a divergent number and functionality of neutrophilic granulocytes during the peripartum period. Genetically mastitis-resistant (GQ, n = 18) and mastitis-susceptible (kq, n = 18) Holstein-Friesian heifers did not differ significantly regarding circulating PMN numbers in peripheral blood. Flow cytometric determination of the phagocytic overall performance using fluorochrome-labeled Staphylococcus aureus and the ROS-generating capacity also revealed no significant differences between the two groups. Subsequently in vivo infection of the udder of GQ and kq cows on day 36 ± 1 after calving with the mastitis-pathogens S. aureus and E. coli did not result in differing total leucocyte counts and PMN numbers in peripheral blood in either group. Moreover the in vivo infection did not alter the phagocytic overall performance and ROS-generating capacity of PMN from GQ and kq cows either. This suggests that infection-dependent processes in the udder of genetically resistant/susceptible cows did not result in a differential release of endocrine acting mediators leading to differential mobilization, migration and modulated function of circulating neutrophils. At the end of the experimental challenge (S. aureus = 96 h, E. coli = 24 h), tissue samples from the udders were immunohistologically analyzed for the presence and quantity of neutrophil granulocytes, based on the expression of epitopes recognized by the monoclonal antibody CH138A. The intention was to ascertain whether the genetically determined mastitis-resistance or -susceptibility is associated with a different recruitment of neutrophilic granulocytes into the udder. Merely inoculation with E. coli resulted in more PMN being verified in the udder parenchyma of kq-cows unlike in GQ-individuals. Based on the modulated expression of the epitope recognized by the antibody used to detect neutrophilic granulocytes, this result indicates that the cell vitality of recruited PMN in the udder of kq-cows is regulated differently than in GQ-cows. For CH138A, the only available specific antibody for bovine granulocytes, the target structure on the PMN surface and its possible expression modulation is unknown. After in vitro incubation of separated neutrophils from blood of non-genotyped cows in the presence of less viable (apoptotic and necrotic) PMN the CH138A epitope was down-regulated by about 40%, supporting the hypothesis that a lower CH138A reactivity in immunhistology is caused by a reduced cell viability. Most interestingly, the CH138A target structure was massively downregulated (78%) in vitro after contact of neutrophils with S. aureus, as opposed to E. coli. In contrast to these inhibitory effects on the expression of the CH138A target molecule, an enhancing effect on the chemokine interleukin 8 (CXCL8) (increase to 110 %) as well as the process of in vitro migration (increase to 180 %) was observed. This kind of surface molecule expression modulation coincided with the CXCL8/migration-induced upregulation of CD11b (increase to 150 %) and the downregulation of L-selectin (CD62L, reduction to 77 %). Whether such differential surface molecule modulations happen in vivo – depending on the genetic background of the cows – will have to be determined. An attempt was made to demonstrate the PMN heterogeneity via the presence of so-called “low density neutrophils” (LDN) in order to investigate if circulating PMN of the genetically selected cows are composed of subpopulations. The initial results revealed evidence for the existence of bovine LDNs based on their variable (< 5 % - > 5 %) presence among mononuclear cells after density gradient separation of whole blood leukocytes, whereas GQ and kq cows showed no difference in the fractions of LDNs. Overall the hypothesis, mastitis-resistance or -susceptibility of divergent BTA18-haplotype heifers is based on a differing number or functionality of circulating neutrophilic granulocytes, could not be confirmed. On the contrary detailed immunohistological analyzes and in vitro experiments on the modulation of the expression of neutrophilic surface molecules indicate that the udder tissue of mastitis-resistant and mastitis-susceptible cows may lead to a differential modulation of immigrating neutrophils depending on the invading pathogen.

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Eickhoff, Tordis: Die Funktionalität und Heterogenität neutrophiler Granulozyten im peripartalen Zeitraum von Kühen mit genetischer Mastitis-Resistenz/-Suszeptibilität. Hannover . Tierärztliche Hochschule Hannover.

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