Die Funktionalität und Heterogenität neutrophiler Granulozyten im peripartalen Zeitraum von Kühen mit genetischer Mastitis-Resistenz/-Suszeptibilität

Polymorphkernige neutrophile Granulozyten (polymorpho-nuclear granulocytes, PMN) gelten als Haupteffektorzellen des angeborenen Immunsystems. Ihre Aufgabe besteht in der Eliminierung eindringender Pathogene sowie der Modulation von Entzündungsreaktionen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde geprüft, ob eine genetisch determinierte Variation für Mastitis-Anfälligkeit und reproduktive Fitness in der genomischen Region des Bos-taurus-Chromosom 18 (BTA18) auf einer divergenten Zahl und Funktionalität neutrophiler Granulozyten im peripartalen Zeitraum beruht. Dabei konnte festgestellt werden, dass sich genetisch Mastitis-resistente (GQ, n = 18) und Mastitis-suszeptible (kq, n = 18) Holstein-Friesian-Färsen nicht in der Anzahl von neutrophilen Granulozyten im peripheren Blut unterscheiden. Die durchflusszytometrische Bestimmung der Phagozytoseleistung mit Hilfe Fluorochrom-markierter Staphylokokken sowie der Bildungskapazität reaktiver Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) ergab, dass sich die beiden Tiergruppen auch in diesen Funktionen peripherer Neutrophiler nicht unterscheiden. Nach experimenteller Infektion von Eutervierteln der GQ- und kq-Kühe am Tag 36±1 nach der Kalbung mit den Mastitiserregern S. aureus und E. coli wiesen beide Tiergruppen ebenfalls keine Unterschiede in der Gesamtleukozytenzahl und der Zahl neutrophiler Granulozyten im peripheren Blut sowie deren Phagozytoseleistung und ROS-Bildungskapazität auf. Daraus kann geschlussfolgert werden, dass die Infektions-abhängigen Prozesse in den Eutervierteln genetisch resistenter/suszeptibler Kühe nicht zur Freisetzung endokrin wirkender Mediatoren führten, welche die Mobilisierung und die Funktion von PMN unterschiedlich beeinflussen. Nach Abschluss des Infektionsversuches (S. aureus = 96 h, E. coli = 24 h) wurden am Tag der Tötung Gewebeproben aus dem Euterparenchym der Versuchstiere gewonnen und immunhistologische Schnitte angefertigt, um zu prüfen, ob sich die genetisch determinierte Mastitis-Resistenz bzw. -Suszeptibilität in einer unterschiedlichen Rekrutierung neutrophiler Granulozyten in das Eutergewebe manifestiert. Nur nach Inokulation mit E. coli konnten mehr PMN im Euterparenchym von kq-Kühen als bei GQ-Individuen ermittelt werden. Unter Zugrundelegung der Expressionsmodulation des Epitops, welches vom verwendeten Antikörper zum Nachweis neutrophiler Granulozyten erkannt wird, deutet dieses Ergebnis darauf hin, dass die Zellvitalität rekrutierter PMN im Euter von kq-Kühen anders reguliert wird als bei GQ-Kühen. Für den bisher einzig verfügbaren spezifischen Antikörper für bovine Granulozyten mit der Bezeichnung CH138A lagen bisher keine Berichte vor, welche Zielstruktur auf der Oberfläche von PMN von diesem Antikörper erkannt werden, ebenso wenig über dessen Expressionsmodulation. Nach In-vitro-Stimulation separierter neutrophiler Granulozyten aus dem Blut nicht genetisch selektierter Kühe konnte gezeigt werden, dass absterbende (apoptotische und nekrotische) PMN das von CH138A erkannte Molekül um bis zu 40 % herunterregulieren. Diese Beobachtung untermauerte die Hypothese der heterogenen Anfärbung der Zellen in der Immunhistologie durch eine divergente Zellvitalität. Weiterhin wurde die CH138A-Zielstruktur durch den Einfluss von S. aureus in vitro massiv (um 78 %) herunterreguliert, was nach Stimulation mit E. coli nicht festgestellt werden konnte. Diesem hemmenden Einfluss auf die Expression des CH138A-Zielmoleküls standen fördernde Einflüsse chemotaktischer Signale durch Interleukin-8 (CXCL8) sowie durch den Vorgang der Migration gegenüber. CXCL8 führte zu einer Hochregulation der Zielstruktur um 10 %, nach dem Prozess der In-vitro-Migration konnte sogar ein 1,8-facher Anstieg der Zielstrukturexpression erfasst werden. Dies deckte sich mit der Expressionsmodulation anderer Zelloberflächenmoleküle auf neutrophilen Granulozyten, von denen die Moleküle CD62L, CD11b und CD172a untersucht wurden. Diese wiesen nach Kontakt der Zellen mit CXCL8 oder erfolgter In-vitro-Migration einen bis zu 1,5-fachen Anstieg der Expression (CD11b) oder eine Herabregulation um bis zu 77 % (CD62L) auf. Die In-vitro-Versuche zur Expressionsmodulation können als richtungsweisend für die tatsächliche Modulation der PMN im Organismus angesehen werden. Um herauszufinden, ob sich unter den zirkulierenden PMN der genetisch selektierten Tiere Subpopulationen von neutrophilen Granulozyten befinden, wurde versucht deren Heterogenität, analog zu Mensch, Maus und Pferd, anhand der Präsenz von neutrophilen Granulozyten geringerer Dichte (low density neutrophils, LDN) beim Rind nachzuweisen. Diese initialen Untersuchungen ergaben Hinweise auf die Existenz von bovinen low density neutrophils. Zwischen GQ- und kq-Kühen bestanden – bei erheblicher Variabilität des LDN-Anteils unter den mononukleären Zellen von unter 5 % bis weit über 5 % - keine Unterschiede. In dieser Arbeit konnte die Hypothese, dass eine unterschiedliche Mastitis-Resistenz bzw. -Suszeptibilität in der genomischen Region von BTA18 auf einer unterschiedlichen Anzahl oder Funktionalität zirkulierender neutrophiler Granulozyten beruht, nicht bestätigt werden. Immunhistologische Detailanalysen und In-vitro-Versuche zur Expressionsmodulation neutrophiler Oberflächenmoleküle deuten jedoch darauf hin, dass das Eutergewebe Mastitis-resistenter und Mastitis-suszeptibler Kühe zu einer differenziellen Modulation immigrierender neutrophiler Granulozyten in Abhängigkeit vom Pathogen führt.