Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Interactions of host defence peptides with innate immune cells : unravelling molecular mechanisms of immune modulation and bacterial killing

Langer, Melissa Natalie

Even though antibiotics and vaccines are generally accessible to most of the global civilization, infectious diseases still cause millions of deaths every year. Treatment with antibiotics is a double-edged sword. On one hand, antibiotics can cure infections; on the other hand, misusage and over usage lead to antibiotic resistance of bacteria. During the last decades more and more multidrug resistant bacteria developed, being a serious threat mainly for pregnant women, young children, the elderly and immunocompromised individuals. Despite educating physicians and patients about the risks and benefits of antibiotics, new anti-bacterial therapies are urgently needed. Host defense peptides (HDPs) are currently under intense discussion as an alternative for antibiotics. They not only directly act on bacteria, but can also alter the immune system towards activation and recruitment of immune cells to the site of infection. Thus, the direct effect of HDPs as well as the immunomodulatory effect will be elucidated in this thesis. In the first part of this thesis, the direct effects of HDPs on bacterial killing were studied by characterization of the minimal inhibitory concentration (MIC). 50 Staphylococcus (S.) aureus and 50 Escherichia (E.) coli mastitis field isolated were tested for their susceptibility towards the bovine cathelicidins BMAP-27 and BMAP-28. Cathelicidins belong to a class of mammalian HDPs, characterized by their small size as well as α-helical, amphipathic and hydrophobic properties. MIC assays used for susceptibility testing of bacterial isolates against antibiotics as described by the Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI) were conducted with HDPs. Since this method was not well characterized for HDPs yet, the homogeneity of MIC variances was tested with four suitable reference strains under different conditions. The effects of temperature, oxygen level and plastic polymers on MIC testing were characterized. Statistical analysis of MIC values revealed strong peptide specific, but also strain specific variances in the technique, indicating that reference strains must be well selected and repeatedly tested. Finally, susceptibility testing of E. coli and S. aureus isolates revealed that BMAP-27 is significantly more effective against E. coli isolates, whilst BMAP-28 shows a significantly higher impact on S. aureus. The second part focusses on the direct effect as well as the immunomodulatory properties of collagen VI on dental implant devices. Application of dental implants into the oral cavity induces massive wounding. Patients frequently get infections due to the presence of a variety of bacterial species in the oral cavity, even though antibiotics are applied post-surgery. In the worst case, the implant cannot integrate into the bone and soft tissue leading to implant loss. Thus, research is currently ongoing into coating dental implants with antibacterial substances. The extracellular matrix (ECM) protein collagen VI is found ubiquitously amongst the human body. Collagen VI was shown to exhibit antimicrobial properties against Gram-Positive and Gram-Negative bacteria. Since the ECM is the first site that is penetrated by bacteria after wounding or surgery the adhesive properties of collagen VI together with the antimicrobial properties of collagen VI serve as a first protection barrier of the host. Collagen VI not only has direct effects on bacteria, but can additionally modulate the immune system in regards to the formation of neutrophils extracellular traps (NETs). NETs were reported to be beneficial in oral healthy since their absence leads to periodontitis. In this study, the bactericidal effect of collagen VI against four oral pathogens on dental implants during the acute phase of infection post-surgery was tested. Additionally, collagen VI was able to induce and stabilize NETs against degradation by bacterial nucleases. Taken together, these results suggest thatv collagen VI can be used as protective novel HDP coating on dental implants to prevent infection and inflammation. Finally, the immunomodulatory properties of HDPs, especially the induction of phagocyte extracellular traps and the role of cholesterol in this process, are elucidated. The human cathelicidin LL-37 as well as the murine homologue CRAMP can induce NETs in human and murine primary neutrophils. The depletion of cholesterol with methyl-β-cyclodextrin (MβCD) from cellular membranes was previously shown to mediate NET formation. A combination of both treatments leads to increased NET release in human and murine cells at early time points. In mast cells (MCs) the treatment with LL-37 and CRAMP respectively, did not induce mast cell extracellular traps (MCET). Since HDPs show higher affinity to low cholesterol membranes, the cholesterol level of neutrophils and MCs were analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC). A significantly higher cholesterol level in murine bone marrow derived MCs in comparison to bone marrow derived murine neutrophils was shown. To unravel if cholesterol is a key mediator for the formation of NETs in response to HDPs, neutrophils of patients with hypercholesterolemia were treated with LL-37 and NET-release was quantified. Patients with defects in amino acid biosynthesis (e.g. phenylketonuria) and normal lipids served as control. However, limited patient data and high variability of data did not lead to a final conclusion and more patient material is needed in the future. This study highlights the importance of HDPs not only as direct antimicrobial agents, but also as immunomodulators, especially in NETosis. A better understanding of the mode of action of HDPs will help to further develop novel targets for clinical approaches based on HDPs.

Obwohl Antibiotika und Impfstoffe gegenwärtig für die Mehrheit der Weltbevölkerung verfügbar sind, verursachen Infektionskrankheiten immer noch Millionen Tote jährlich. Insbesondere die Behandlung mit Antibiotika stellt ein zweischneidiges Schwert dar. Auf der einen Seite können Antibiotika Infektionskrankheiten bekämpfen, auf der anderen Seite führen unsachgemäßer Gebrauch und übermäßiger Einsatz zu Antibiotikaresistenz bei Bakterien. Während der letzten Jahrzehnte traten mehr und mehr multiresistente Bakterien auf, die vor allem für Schwangere, Kleinkinder, Ältere sowie immungeschwächte Patienten eine ernstzunehmende Bedrohung darstellen. Neben einer ausführlichen Aufklärung von Ärzten und Patienten, werden neue anti-infektive Therapien dringend benötigt. Wirtsabwehrpeptide (engl. Host defense peptides; HDPs) werden zurzeit intensiv als Alternative für Antibiotika diskutiert. Sie können nicht nur direkt auf Bakterien wirken, sondern auch indirekt, indem sie das Immunsystem zur Aktivierung und Rekrutierung von Immunzellen zur infizierten Stelle hin stimulieren. Daher werden in dieser These sowohl der direkte Effekt der HDPs auf Bakterien als auch die immunmodulatorischen Fähigkeiten einzelner HDPs beschrieben. Der direkte Effekt von HDPs bezüglich der Abtötung von Bakterien wurde mittels minimaler inhibitorischer Konzentration (MIC) der HDPs getestet. Von 50 Staphylococcus (S.) aureus und 50 Escherichia (E.) coli Mastitisisolaten wurde die Empfindlichkeit gegenüber den bovinen Cathelizidinen BMAP-27 und BMAP-28 ermittelt. Cathelizidine gehören zu einer Klasse von Säuger-HDPs, die durch ihre kleine Abmessung, sowie α-helikalen, amphipathischen und hydrophobischen Eigenschaften charakterisiert sind. Versuche zur Bestimmung der MIC, wurden - wie durch das Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI) für Antibiotika beschrieben – mit HDPs durchgeführt. Da diese Methode für HDPs bisher noch nicht charakterisiert wurde, wurde die Varianzhomogenität der MIC-Werte mit vier geeigneten bakteriellen Referenzstämmen unter verschiedenen Bedingungen getestet. Hierbei wurden die Effekte von Temperatur, Sauerstoffgehalt und Plastikpolymeren auf MIC-Wertecharakterisiert. Die statistische Analyse der MIC-Werte zeigte sowohl starke Peptid-spezifische als auch Stamm-spezifische Varianzen, die darauf hinweisen, dass Referenzstämme sorgsam ausgewählt und mehrfach getestet werden sollten. Schlussendlich zeigte die Empfindlichkeitstestung der E. coli und S. aureus Isolate, dass BMAP-27 signifikant effektiver gegen E. coli wirkt, während BMAP-28 einen signifikant höheren Effekt gegen S. aureus aufweist. Während des operativen Einsetzens von Zahnimplantaten kommt es zu massiven Gewebsverletzungen und Blutungen in der Mundhöhle. Oft infizieren sich die Wunden der operierten Patienten aufgrund der hohen Anzahl bakterieller Spezies, die die Mundhöhle besiedeln. Im schlimmsten Fall können sich die Implantate während des Heilungsprozesses nicht in den Knochen und das Gewebe integrieren und fallen aus. Aufgrund dessen werden antibakterielle Implantatbeschichtungen in der Zahnmedizin stark diskutiert. Das extrazelluläre Matrixprotein (ECM) Kollagen VI kommt ubiquitär im menschlichen Körper vor. Kollagen VI hat antibakterielle Eigenschaften gegen Gram-Positive und Gram-Negative Bakterien. Die ECM ist das erste Gewebe, das nach Verletzungen oder Operationen von Bakterien besiedelt wird. Daher bilden die adhäsiven Eigenschaften, sowie das antibakterielle Kollagen VI die erste Schutz- Barriere von dem Wirt. Kollagen VI verfügt jedoch nicht nur über direkte antimikrobielle Eigenschaften, sondern ermöglicht auch eine Modulation des Immunsystems in Bezug auf die Bildung von Neutrophilen extrazellulären Netzen (NETs). Es ist bekannt, dass NETs für die orale Gesundheit von Vorteil sind, da ihre Abwesenheit zu Periodontitis führt. In dieser Studie wurde gezeigt, dass Kollagen VI antimikrobielle Eigenschaften gegen orale Pathogene auf Zahnimplantaten aufweist. Dieses Phänomen hält auch während der akuten Entzündungsphase nach einer Operation an. Zusätzlich kann Kollagen VI NETs induzieren und gegen die Degradation bakterieller Nukleasen stabilisieren. Zusammengefasst schlagen diese Ergebnisse Kollagen VI als neues HDP vor, das als protektive Beschichtung von Zahnimplantaten dienen kann um Individuen vor Infektionen und Entzündungen zu schützen. Zuletzt werden die immunmodulatorischen Eigenschaften der HDPs, insbesondere bei der Induktion von phagozytischen, extrazellulären DNA NETs und die Rolle von Cholesterin in diesem Prozess, aufgeklärt. Das humane Cathelizidin LL-37, sowie das murine Homolog CRAMP, können extrazelluläre NETs in primären humanen und murinen Neutrophilen induzieren. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die Depletion von Cholesterin in zellulären Membranen mittels Methyl-β-Cyclodextrin (MβCD) auch zur NETs-Bildung führt. Eine Kombination aus beiden Behandlungen führte zu frühen Zeitpunkten zu erhöhter NET-Bildung in humanen und murinen Zellen. In Mastzellen (MCs) wurden bei der Behandlung mit LL-37 oder CRAMP keine Bildung von Mastzell-extrazellulären NETs (MCETs) nachgewiesen. Da HDPs eine höhere Affinität zu Membranen mit niedrigem Cholesterin-Level haben, wurde der Cholesteringehalt in Neutrophilen und MCs mittels HPLC analysiert. Dabei wurde ein signifikant höherer Cholesteringehalt in murinen MCs aus dem Knochenmark (BMMCs) festgestellt. Um zu untersuchen ob Cholesterin eine Schlüsselkomponente in HDP-vermittelter NET-Bildung ist, wurden Neutrophile von Patienten mit Hypercholesterinämie isoliert, mit LL-37 behandelt und auf NETs-Bildung analysiert. Patienten mit Störungen im Aminosäurestoffwechsel (z.B. Phenylketonurie) und normalem Lipidprofil dienten hierbei als Kontrollen. Aufgrund der geringen Probenzahl und hohen Variabilität der Ergebnisse, konnte keine finale Aussage getroffen werden. Dafür wird in Zukunft mehr Patientenmaterial t benötigt. Diese Studie fasst die Bedeutung der HDPs sowohl als direkte antibakterielle Substanzen, als auch ihre Funktion als Immunmodulatoren, insbesondere bei der Induktion der NETose, zusammen. Insgesamt stellt sie HDPs als interessanten Ansätzen für klinische Lösungsansätze vor.

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Langer, Melissa: Interactions of host defence peptides with innate immune cells. unravelling molecular mechanisms of immune modulation and bacterial killing. Hannover . Tierärztliche Hochschule Hannover.

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