Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Pathophysiology of Niemann-Pick Type C and Fabry diseases with Emphasis on Membrane Composition and Protein Trafficking

Shammas, Hadeel

Lysosomal storage diseases (LSDs) are a group of progressive inherited metabolic disorders caused by compromised function of lysosomal proteins/enzymes. This leads to a progressive lysosomal accumulation of metabolites or untrafficked molecules in the late endosomes/lysosomes (LE/L). In our study we focus on two LSDs: Niemann-Pick disease type C (NP-C) (cholesterol storage disease) and Fabry disease (FD) (glycolipid storage disease). NP-C disease is caused by a mutation in the lysosomal protein NPC1 (95 % of the cases) or NPC2 (5 % of the cases). The clinical spectrum of NP-C ranges from a neonatal fatal disorder to adult-onset cases. Our aim was to understand the implication of particular mutations at the molecular level and its correlation with clinical parameters like the age at onset of symptoms and the severity of the disease. To analyse the structural features, maturation pathways and subcellular localization in common mutations of NPC1, a cDNA construct harboring the mutation of interest was generated using site-directed mutagenesis PCR and expressed in mammalian cells. Interestingly, we were able to classify NPC1 mutants into three different clusters according to their trafficking pattern along the secretory pathway and their localization in the cellular compartments. The first cluster included mutations that were blocked in the ER as immature mannose-rich proteins, while the second group comprised mutations that were partially trafficked through the Golgi to the lysosomes. The third cluster included mutations that exhibited a pattern of trafficking and localization similar to the wild type. In addition, the three classes varied also in their association with lipid rafts (LRs) and in their turnover rate. This is the first molecular analysis that relates different mutations in NPC1 with the trafficking behavior of NPC1 protein along the secretory pathway. These results can explain the variable biochemical presentation among the patients, the heterogeneity of symptoms and the response towards the current therapeutic agent for NP-C N-butyldeoxynojirimycin (NB-DNJ, Miglustat). The concept in this study might help to correlate the genotype with the clinical phenotype of NP-C disease and propose a mutation-based personalized therapeutical approach. On the other hand, the disruption of lipid homeostasis is a major feature in FD,in which the malfunction of alpha-galactosidase A (GLA) causes accumulation of glycosphingolipids (GSLs) in the lysosomes. Since GSLs are one of the major components in LRs together with cholesterol, we suggested that the LRs composition in FD might be impaired as downstream consequences of cellular lipid alteration. Our results indicate that the N215S mutation causes impairment of GLA trafficking revealed by the treatment of the protein with endoglycosidase H (endo H). The consequence of the defect in trafficking of GLA was investigated by analyzing LR composition. Interestingly, abnormalities in LRs composition in the Fabry fibroblasts were observed based on the altered distribution of flotillin-2 in addition to cholesterol and GLSs analysis. Moreover, treatment of Fabry cells with 50µM or 100µM Miglustat reverted the LRs to a wild type-pattern. In this study we were able to show that LRs play a key role in LSDs. This may help to better understand the pathophysiology in LSDs and possibly identify novel biomarkers.

Lysosomale Speichererkrankungen (LSDs) sind eine Gruppe progressiv verlaufender, angeborener Stoffwechselerkrankungen, hervorgerufen durch die beeinträchtigte Funktion von lysosomalen Proteinen oder Enzymen. Hierdurch kommt es zu einer Akkumulation von Metaboliten oder nicht transportierten Molekülen in den späten Endosomen und Lysososmen. In dieser Studie lag der Fokus auf zwei LSDs: Morbus Niemann-Pick Typ C (NP-C) (Cholesterol Speichererkrankung) und Morbus Fabry (FD) (Glykolipid Speichererkrankung) NP-C wird durch Mutationen der lysosomalen Proteine NPC1 (in 95% der Fälle) oder NPC2 (in 5% der Fälle) hervorgerufen. Das klinische Spektrum reicht hierbei von einer neonatalen, letalen Erkrankung bis zu einer adulten Form. Ziel der Studie war es, zu klären, welchen Einfluss spezifische Mutationen auf Molekülebene haben und ob es eine Korrelation zwischen spezifischen Mutationen und klinischen Parametern wie Schwere der Krankheit und Alter zum Zeitpunkt der ersten Symptome gibt. Zur Analyse der Parameter Struktur, Prozessierung und intrazellulären Lokalisation bei gängigen NPC1 Mutationen, wurden cDNA-Konstrukte mit den spezifischen Mutationen mittels gezielter Mutagenese (site-directed mutagenesis PCR) hergestellt und in Säugerzellen exprimiert. Interessanterweise war es möglich die untersuchten NPC1-Mutationen anhand von Parametern wie intrazellulärer Lokalisation und Sekretionswegen in drei unterschiedliche Gruppen einzuteilen. Die erste Gruppe beinhaltet Mutationen, welche zu einer Anhäufung von unfertigen, mannosereichen Proteinformen im Endoplasmatischen Retikulum führen. Die zweite Gruppe hingegen weist Mutationen auf, welche zu einem partiellen Transport über den Golgi-Apparat in die Lysosomen führen. Die dritte Gruppe wird von Mutationen gebildet, welche hinsichtlich Transport und Lokalisation keine Unterschiede zum Wildtyp aufweisen. Zusätzlich unterscheiden sich die drei Gruppen in ihrer Assoziation mit lipid rafts (LRs) und in ihren Umsatzraten. Bei dieser Studie handelt es sich um die erste molekulare Analyse von verschiedenen NPC1-Mutationen hinsichtlich des Transport-Verhaltens des NPC1-Proteins entlang der Sekretionswege. Die hier dargestellten Ergebnisse sind eine mögliche Erklärung für die stark variierenden biochemischen Merkmale der Patienten und der Heterogenität ihrer Symptome sowie der variablen Antwort auf das gängige Therapeutikum für NP-C, N-butyldeoxynojirimycin (NB-DNJ, Miglustat). Das Konzept der Klassifizierung in dieser Studie kann genutzt werden, um eine Korrelation zwischen dem Genotyp und dem klinischen Phänotyp der NP-C Erkrankung zu ziehen und stellt somit einen Ansatz für eine mutationsbasierte personalisierte Therapie dar. Die Störung der Lipid-Homöostase ist auch bei FD ein wichtiges Merkmal. Hierbei kommt es durch die Fehlfunktion der alpha-Galaktosidase (GLA) zu einer Anhäufung von Glykosphingolipiden (GSLs) in denLysosomen. Die Glykosphingolipide stellen neben Cholesterol einen der Hauptbestandteile der LRs dar. Daraus ergibt sich, dass eine Störung des Glykosphingolipid-Haushaltes bei FD möglicherweise zu einer veränderten Komposition der LRs führt. Mittel einer Endoglycosidase H (endo H) Behandlung von GLA konnte gezeigt werden, dass die N215S Mutation zu einer Störung des GLA-Transportes führt. Als Folge des gestörten Transportes konnte gezeigt werden, dass die Veränderung der LR-Zusammensetzung gestört war. Dies zeigte sich nicht nur bei Cholesterol und GLSs, sondern auch durch eine veränderte Flotilin-2 Verteilung in den LRs. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass eine Behandlung mit 50µM oder 100µM Miglustat in Fabry-Fibroblasten zu einer Normalisierung des Phänotyps führte. Diese Studie zeigt somit, dass LRs eine essenzielle Rolle in LSDs spielen und sie somit für das Verständnis der Pathophysiologie und als potenzielle Biomarker ein entscheidender Faktor sein können.

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Shammas, Hadeel: Pathophysiology of Niemann-Pick Type C and Fabry diseases with Emphasis on Membrane Composition and Protein Trafficking. Hannover 2018. Tierärztliche Hochschule Hannover.

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