Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchung modifizierter Implantatoberflächen für den orthopädischen Einsatz zur Reduzierung implantatassoziierter Infektionen im Rattenmodell

Schröder, Marie-Luise

Implantatassoziierte Infektionen sind in der orthopädischen Chirurgie eine der am schwierigsten zu behandelnden Komplikationen. Die Behandlung der Infektionen geht mit einer hohen Belastung für den Patienten und hohen Kosten für das Gesundheitssystem einher. Die Biofilmbildung der Infektionserreger und die steigenden antibiotischen Resistenzen sind zwei der wichtigsten Probleme bei der Behandlung von Implantatinfektionen. Deshalb gibt es einen hohen Forschungs-bedarf im Bereich der prophylaktischen und therapeutischen Strategien zur Bekämpfung von Implantatinfektionen. Die Funktionalisierung von Implantat-oberflächen stellt dabei ein großes Forschungsfeld dar. Eine Möglichkeit ist die Strukturierung der Oberfläche durch ultra-kurz gepulste Laserablation, durch die bakterienabweisende Strukturen generiert werden können. Mit diesem Verfahren hergestellte Spikestrukturen zeigten in vitro in Abhängigkeit von der Spikegröße Unterschiede in der bakteriellen und zellulären Besiedlung. Mit kleineren Spikes (5-6 µm) versehene Implantatoberflächen stellten einen vielversprechenden Ansatz für die Reduktion von Implantatinfektionen dar. Um die Hypothese der Infektionsreduktion durch Verwendung der speziellen Implantat-oberflächen zu überprüfen, sollten die Strukturen präklinisch in einem passenden in vivo Modell im Rahmen des Forschungsverbundes „Biofabrication for NIFE“ getestet werden. Für die Auswertung der in vivo Studien waren die richtigen Evaluationsmethoden essentiell. Nicht nur die Menge der bakteriellen Besiedlung auf der Implantatoberfläche sollte untersucht werden, sondern auch das morphologische Erscheinungsbild der Biomasse, um beispielsweise zwischen Biofilm und planktonischen Bakterien zu unterscheiden. Diese Kombination aus beiden Evaluationsmethoden wurde bisher noch nicht durchgeführt. Daher wurde zunächst in einer Pilotstudie ein Rattenmodell für einen rattenpathogenen Staphylococcus aureus Stamm erarbeitet. Es musste festgestellt werden, welcher Infektionsweg und welche Infektionskonzentration geeignet waren, um eine low-grade ähnliche implantatassoziierte Infektion zu modellieren. Des Weiteren wurde eine Methode für die CLSM-basierte Quantifizierung der bakteriellen Besiedlung in Kombination mit der morphologischen Beurteilung etabliert. Für das Auslösen der implantatassoziierten Infektion wurde ein quaderförmiger Ti90/Al6/V4-Stab in die Tibia der Ratte implantiert und mit dem Staphylococcus aureus Stamm 36/07 über die Injektion einer Bakteriensuspension in verschiedenen Konzentrationen (103, 104, 105 und 106 KBE/10 µl) intraoperativ infiziert. Als alternative Infektionsmethode wurden bakteriell vorbesiedelte Implantate verwendet. Score-basierte radiologische und histologische Auswertungsverfahren wurden für die semiquantitative Beurteilung von infektionsbedingten Knochen- und Gewebe-veränderungen nach einem Untersuchungszeitraum von drei Wochen verwendet. Die bakterielle Infektionslast wurde durch konfokalmikroskopische Aufnahmen der Implantatoberfläche nach Lebend/Tot- Färbung ermittelt. Die Quantifizierung der vitalen bakteriellen Biomasse wurde mit zwei verschiedenen Methoden (Volumen-Methode und Spot-Methode) durchgeführt und mit einem Scoresystem kombiniert, welches die morphologischen Besonderheiten der Biofilmbildung auf der Implantatoberfläche wiederspiegelt. In der Pilotstudie wurde mit sinkender Infektionskonzentration eine Tendenz zur zunehmenden Biofilmformation, sowohl quantitativ, als auch morphologisch festgestellt. Die radiologische und histologische Evaluation ergab stärkere Knochen-veränderungen mit steigender Infektionskonzentration. Damit entsprach die Injektion der Bakteriensuspension in der Konzentration von 103 KBE/10 µl am besten dem klinischen Bild der low-grade Infektion und eignete sich daher für den Einsatz in der Hauptstudie. Für die Beurteilung der bakteriellen Infektionslast auf der Implantatoberfläche stellte sich die Volumen-Methode als die am besten geeignete Methode heraus. In der Hauptstudie wurde mit den etablierten Methoden aus der Pilotstudie eine laserstrukturierte Oberfläche mit Spikestrukturen (circa 5 µm) im Hinblick auf die Hypothese geprüft, dass die Laserstrukturierung der Oberfläche möglicherweise die Infektionslast der Implantatoberfläche reduziert. Allerdings zeigte sich in den Untersuchungen ein gegenteiliger Effekt. Die Evaluation der explantierten laserstrukturierten Oberfläche am Ende des Untersuchungszeitraumes von 21 Tagen ergab zwar eine stärkere zelluläre Besiedlung mit eukaryotischen Zellen und damit eine verstärkte Integration in den Knochen im Vergleich zur polierten Referenzoberfläche, die bakterielle Besiedlung war aber, im Gegensatz zu den in vitro Studien, stärker als die der Referenzstruktur. Die radiologischen und histologischen Auswertungen ergaben stärkere infektionsbedingte Veränderungen des Knochens bei Verwendung der Spikestruktur im Vergleich zur Referenzstruktur aus der Pilotstudie. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Studie auf der einen Seite die Wichtigkeit von in vivo Modellen in der präklinischen Testung von neuen Implantatmaterialien und auf der anderen Seite, dass die geprüften laser-strukturierten Oberflächen derzeit nicht geeignet sind, die bakterielle Besiedlung zu reduzieren. Allerdings stellen sie durch ihr gutes Anlagerungsvermögen für eukaryotische Zellen und der daraus resultierenden starken Verankerung im Knochen einen Ausgangspunkt für weitere Modifikationen dar, welche gezielt die antibakterielle Wirkung adressieren könnten.

Implant associated infections are among the major problems in orthopaedic surgery, which can result in devastating complications for the patients and high costs for the health system. Biofilm formation and rising numbers of antibiotic resistance of the infection agents are two major threats for the therapy of implant associated infections. Therefore, prevention and therapeutic strategies are two research foci amongst others to reduce implant infections. Diminution of implant associated infections can be achieved by functionalization of implant surfaces, which reduce the adhesion of bacteria. One method to generate such surfaces is the femtosecond laser based modification of the implant surface. Spike structures, which were manufactured with this method, showed a better cellular adhesion and decreasing bacterial adhesion on smaller spikes structures (5-6 µm) compared to larger spike structures (10-20 µm) in vitro. Such structures are a promising approach for the reduction of implant associated infections. To verify this hypothesis, it was the aim of the study to test the modified surface in a suitable animal model within the research association “Biofabrication for NIFE”. For the analysis of in vivo studies, proper evaluation methods are essential to quantify the bacterial load on the implant surface and to assess the morphological organization of the bacteria to differentiate between biofilm and planktonic bacteria. Up to now the simultaneous assessment of quantity and morphology of the bacterial load on the implant surface in vivo has not been described. The establishment of an in vivo rat model with a similar appearance than a human low-grade infection was established in a pilot study. The suitable route of infection and the inoculation concentration had to be determined to model the low-grade like symptoms. A quantification method for the bacterial colonisation on the implant surface in combination with the evaluation of the bacterial morphology was implemented. In the main study, a laser structured implant surface was tested for its capacity to reduce the implant associated infection. To establish the implant associated infection, cubic Ti90/Al6/V4-rods were implanted in the tibia of rats and infected intraoperatively with a bacterial suspension (103, 104, 105, 106 CFU/10 µl) of the Staphylococcus aureus strain 36/07. Bacterial pre-cultivated implants were used as an alternative onset of the infection. Score-based radiological and histological evaluation methods were used for the semiquantitative assessment of infection-related bone and tissue alterations after an examination period of three weeks. The bacterial load was assessed with confocal microscopic images of the implant surface after LIVE/DEAD staining. The quantification of the vital bacterial biomass on the implant surface was performed with the Imaris® x64 software package using two different methods (volume and spot method) and combined with a scoring system, which displays the morphological characteristics of biofilm formation on the implant surface. A tendency towards increasing biofilm formation with decreasing infection concentration was observed in the quantity of the bacterial load and the morphologic evaluation. Radiographic and histologic analysis revealed an increased score and therefore more severe alterations of the bone structure with increasing infection concentrations. The injection of a bacterial suspension in the concentration of 103 CFU/10 µl was defined as the most suitable route of application and concentration to mimic low-grade infection like symptoms. Therefore, this concentration was used in the main study. For the quantification of the bacterial burden on the implant surface, the volume method was determined to be the most suitable method. In the main study, a laser structured implant surface with spike structures (approximately 5 µm) was tested, which should reduce the infectious burden on the implant surface. After an examination period of three weeks, the laser structured surface displayed a better integration into the bone and a higher eukaryotic cellular colonization compared to the reference structure. In contrast to the in vitro results, the bacterial load on the laser structured implant surface showed a higher bacterial load compared to the group with the reference structure. The infection related bone and tissue alterations showed more severe alterations in the group with the laser structured implants compared to the group with the reference implants. The results of this study underline the importance of the use of animal models in preclinical testing. The current laser structures are not suitable to reduce the infectious load on the implant surface. Because of the high cellular colonization and the strong integration of the implant into the bone, the laser structure can be a basis for further modifications, which target the antibacterial effect specifically.

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Schröder, Marie-Luise: Untersuchung modifizierter Implantatoberflächen für den orthopädischen Einsatz zur Reduzierung implantatassoziierter Infektionen im Rattenmodell. Hannover 2018. Tierärztliche Hochschule Hannover.

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