Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Molekulare Charakterisierung von Staphylococcus aureus, ESBL-/AmpC-bildenden Escherichia coli und Salmonella enterica aus legal und illegal aus Drittländern eingeführten Lebensmitteln

Müller, Anja

Jährlich werden in großem Umfang Fleisch und Fleischprodukte aus Drittländern in die EU eingeführt. Neben dem legalen Import werden auch nicht unerhebliche Mengen dieser Produkte illegal eingeführt, beispielsweise im Reisegepäck. Über kontaminiertes Fleisch könnte somit auch die globale Verbreitung von Zoonoseerregern und antimikrobiellen Resistenzen gefördert werden. Jedoch wurden bisher nur in wenigen Studien gezielt einzelne Isolate untersucht, die auf diesen Wegen nach Deutschland bzw. in die EU gelangen. Besonders über Isolate, die sich auf illegal eingeführten Produkten befinden, gibt es bisher kaum Informationen. Daher erfolgte im Rahmen dieser Arbeit eine eingehende Charakterisierung von Zoonoseerregern, die aus legal und illegal importierten Fleischwaren gewonnen wurden, mit dem Ziel zu überprüfen, ob solche Produkte ein mögliches Reservoir für resistente und/oder besonders virulente Stämme der untersuchten Bakterienspezies darstellen. Dabei wurden Isolate von drei klinisch relevanten Bakterienspezies untersucht, die eine wichtige Rolle als Erreger von Lebensmittelinfektionen bzw. –intoxikationen spielen und zudem systemische Erkrankungen hervorrufen können. Dies umfasste Methicillin-resistente (MRSA, n = 9) sowie Methicillin-sensible Staphylococcus aureus (MSSA, n = 14), AmpC- oder extended-spectrum β-Laktamase (ESBL)-produzierende Escherichia coli (n = 36) sowie Salmonella enterica (n = 5). Es erfolgte eine molekulare Typisierung der jeweiligen Isolate sowie eine eingehende Charakterisierung hinsichtlich ihres Resistenzphänotyps und ‑genotyps. Für S. aureus und E. coli-Isolate erfolgte zusätzlich ein spezifischer Nachweis Virulenz-assoziierter Gene. Dabei kamen für die jeweilige Spezies geeignete Methoden zum Einsatz. Diese umfassten antimikrobielle Empfindlichkeitstestungen, verschiedene Typisierungsverfahren, Mikroarray-Analysen, PCR-Assays, Ganzgenomsequenzierung, Sequenzanalysen einzelner Gene und Konjugations-Experimente. Unter den 23 untersuchten S. aureus-Isolaten, darunter neun MRSA aus illegal eingeführten Fleischprodukten, wurden diverse Resistenzen nachgewiesen und 14 Isolate waren resistent gegenüber Wirkstoffen aus drei oder mehr Wirkstoffklassen. Zudem wurden teilweise ungewöhnliche Resistenzmuster beobachtet. So wiesen einige der S. aureus-Isolate, die keinen MRSA-Genotyp aufwiesen, eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Oxacillin auf. Bei einem weiteren S. aureus-Isolat wurde zudem eine ungewöhnliche Variante des Phenicol-Resistenzgens fexA identifiziert, welche lediglich eine Resistenz gegenüber Chloramphenicol vermittelt, jedoch nicht gegenüber Florfenicol. Die molekulare Typisierung zeigte eine deutliche genetische Heterogenität unter den Isolaten. Kein Isolat gehörte zu dem in der EU typischen Nutztier-assoziierten klonalen Komplex CC398. Stattdessen konnten viele der Isolate anhand der Ergebnisse der Erreger-Typisierung klonalen Linien zugeordnet werden, die häufig beim Menschen vorgefunden werden (sak-, chp-, scn-positive Isolate des CC1, CC5, CC80). Des Weiteren wurden teils bedeutende Virulenzdeterminanten nachgewiesen, darunter diverse Gene, die für Enterotoxine codieren, einschließlich sea und sed, sowie Gene für verschiedene weitere bedeutende Virulenzfaktoren wie das Panton-Valentin-Leukozidin, das Toxic Shock Syndrome Toxin-1 (tst1) und das exfoliative Toxin D (etD). Es wurden zudem insgesamt 36 ESBL-/AmpC-bildende E. coli untersucht, darunter drei aus illegal importierten Fleischwaren. Die Bestimmung der β-Laktamasegene der 36 ESBL-/AmpC-bildenden E. coli zeigte, dass blaCTX-M-2 das häufigste ESBL-Gen unter den Isolaten war, gefolgt vom AmpC-β-Laktamasegen blaCMY-2 und blaCTX-M-8. Im Gegensatz dazu tragen ESBL-Bildner von Nutztieren und von Fleischprodukten in der EU überwiegend blaCTX-M-1, blaTEM-52 oder blaSHV-12. Neben der Resistenz gegenüber β-Laktamen konnten diverse phänotypische und genotypische Resistenzen gegenüber weiteren Wirkstoffklassen nachgewiesen werden. Besonders häufig waren Resistenzen gegenüber Tetrazyklin, Sulfamethoxazol/Trimethoprim und Gentamicin. Eine beträchtliche Anzahl der E. coli-Isolate zeigte zudem eine verminderte Fluorchinolon-Empfindlichkeit und neun der Isolate trugen Plasmid-vermittelte Chinolon-Resistenzdeterminanten (qnrB oder qnrS). Auch bei den E. coli-Isolaten konnte mittels verschiedener Typisierungsverfahren eine deutliche genetische Heterogenität nachgewiesen werden. So konnten insgesamt 25 unterschiedliche Multilokus-Sequenztypen ermittelt werden sowie alle vier phylogenetischen Hauptgruppen (A. B1, B2, D) nachgewiesen werden, wobei die Isolate besonders oft zur Gruppe D gehörten. Diese umfasst zusammen mit Gruppe B2 den Großteil aller extra-intestinal pathogenen E. coli. Es konnten zudem verschiedene Virulenz- und Fitness-assoziierte Gene nachgewiesen werden, darunter hlyE, iroN und astA. Häufig wurden Gene nachgewiesen, welche oft bei Geflügel-assoziierten Isolaten vorkommen (iss, tsh). Ein Isolat trug zudem Gene, die typisch für enteropathogene E. coli sind, darunter eae, espB_O26 und Gene für ein Typ-III-Sekretionssystem. Von den insgesamt fünf Salmonella enterica subsp. enterica-Isolaten wurden zwei Isolate aus illegal importiertem Fleisch als S. Infantis und S. Weltevreden identifiziert. Während das S. Infantis-Isolat Resistenzen gegenüber Wirkstoffen aus fünf Wirkstoffklassen aufwies, zeigte das S. Weltevreden-Isolat keinerlei phänotypische Resistenzen. Die drei Isolate aus legalen Importen gehörten zum Serovar Heidelberg oder waren unbegeißelt. Alle drei Isolate aus legalen Importen zeigten Resistenzen gegenüber Cephalosporinen der dritten Generation und trugen das AmpC-β-Laktamasegen blaCMY-2. Sie waren zudem resistent gegenüber Ciprofloxacin, Tetrazyklin sowie Sulfamethoxazol. Dies ist bedenklich, da Co-Resistenzen gegenüber Cephalosporinen der dritten Generation und Fluorchinolonen bei nicht-typhoiden Salmonellen in der EU derzeit selten sind. Die blaCMY-2-Gene der Isolate lagen jeweils auf konjugativen Plasmiden, die sich auf einen E. coli-Empfängerstamm übertragen ließen. In zwei Fällen erfolgte ein Co-Transfer der Gene sul2 und tet(A), welche für Sulfonamid- bzw. Tetrazyklinresistenz codieren. Insgesamt konnte im Rahmen dieser Arbeit aufgedeckt werden, dass legal sowie illegal importierte Fleischwaren S. aureus, E. coli- und Salmonella enterica-Isolate beherbergen können, die mitunter multiple antimikrobielle Resistenzen und bedeutsame Virulenzdeterminanten aufweisen. Viele Isolate unterschieden sich genetisch deutlich von jenen, die in der EU üblicherweise auf Fleischprodukten nachgewiesen werden und es wurden bisher unbeschriebene Genvarianten identifiziert. Zudem wiesen die Isolate mitunter ungewöhnliche Resistenzphänotypen auf. In der Folge könnte es zu einer Infektion oder Besiedlung von Personen durch solche resistenten Stämme kommen. Des Weiteren besteht die Möglichkeit einer Übertragung von derzeit in der EU wenig verbreiteten Resistenzdeterminanten auf andere Bakterienstämme durch horizontalen Gentransfer. Der internationale Handel und die illegale Einfuhr von Fleisch und Fleischprodukten könnten somit die Ausbreitung von Zoonoseerregern und antimikrobiellen Resistenzen über weite Strecken fördern.

Meat and meat products are imported into the EU in large quantities. In addition to legal imports, considerable amounts of these products are introduced illegally, for example in passenger luggage. This might facilitate the global spread of zoonotic pathogens and antimicrobial resistances through contaminated meat. However, to date, few studies provide information about the characteristics of individual isolates entering Germany and the EU in these ways. The available data on strains isolated from illegally imported meat is particularly scarce. For this reason, the present study focused on a detailed characterization of zoonotic pathogens recovered from legally and illegally imported meat and meat products. Isolates of three different clinically relevant bacterial species, which can cause foodborne infections or intoxications as well as systemic infections, were included in the analyses. These comprised methicillin-resistant (MRSA, n = 9) and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus (MSSA, n = 14), AmpC- or extended-spectrum β-lactamase (ESBL)-producing Escherichia coli (n = 16), and Salmonella enterica (n = 5). The genetic relationship of the isolates within each species was determined using different molecular typing procedures. All isolates were further examined regarding their antimicrobial resistance phenotype and genotype. For this purpose, several methods were used, including antimicrobial susceptibility testing, PCR assays, whole genome sequencing, sequence analyses of individual genes and conjugation experiments. S. aureus- and E. coli-isolates were additionally tested for the presence of major virulence-associated genes. Various antimicrobial resistances were identified among the 23 S. aureus isolates, including nine MRSA recovered from illegally imported meat products, and 14 isolates were resistant to substances from three or more classes of antimicrobials. Additionally, unusual resistance patterns were observed. Several isolates lacking an MRSA genotype showed borderline resistance to oxacillin. Another isolate carried an unusual variant of the phenicol-resistance gene fexA, which conferred resistance to chloramphenicol but not to florfenicol.Molecular typing results revealed a marked genetic heterogeneity among the S. aureus isolates. No isolate belonged to CC398, the predominant livestock-associated clonal complex in Western Europe. Instead, many isolates belonged to clonal lineages frequently found in humans (sak-, chp-, scn-positive isolates of CC1, CC5, CC80). Moreover, major virulence-associated determinants were identified among the isolates. These comprised genes encoding enterotoxins, including sea and sed, as well as genes coding for other important virulence factors such as the Panton-Valentin leucocidin, toxic shock syndrome toxin-1 (tst1) and exfoliative toxin D (etD). Furthermore, a total of 36 ESBL-/AmpC-producing E. coli were examined, including three isolates from illegally imported meat products. The identification of their respective β-lactamase genes revealed that blaCTX-M-2 was the most prevalent ESBL gene among the isolates, followed by the AmpC β-lactamase gene blaCMY-2 and blaCTX-M-8. In contrast to this, ESBL producers isolated from livestock or meat in the EU most frequently carry blaCTX-M-1, blaTEM-52 or blaSHV-12. In addition to β-lactam-resistance, a variety of phenotypic and genotypic resistances against other classes of antimicrobial agents was determined among the isolates. Most common were resistances to tetracycline, sulfamethoxazole/trimethoprim and gentamicin. In addition, many isolates displayed a decreased susceptibility to fluoroquinolones and nine of the 36 isolates carried plasmid-mediated quinolone-resistance determinants (qnrB or qnrS). Different typing methods revealed a considerable genetic heterogeneity among the isolates. A total of 25 different multilocus sequence types were determined and all four major phylogenetic groups (A, B1, B2, D) were identified. Phylogenetic group D was particularly prevalent. This group, together with group B2, comprises most extraintestinal pathogenic E. coli. In addition, various virulence- and fitness-associated genes were identified, such as hlyE, iroN and astA. Most prevalent were genes frequently associated with isolates recovered from poultry (iss, tsh). One isolate carried genes that are characteristic for enteropathogenic E. coli, including eae, espB_O26 and genes encoding a type III secretion system. Of the five Salmonella enterica subsp. enterica isolates, two isolates from illegally imported meat, were identified as S. Infantis and S. Weltevreden. Whereas the S. Infantis isolate was resistant against substances from five classes of antimicrobials, the S. Weltevreden did not display any antimicrobial resistances. The three isolates recovered from legal imports belonged to the serovar Heidelberg or were non-flagellated. All three isolates from legal imports were resistant to third generation cephalosporins and carried the AmpC β-lactamase gene blaCMY-2. They were additionally resistant to ciprofloxacin, tetracycline and sulfamethoxazole. This is worrying as co-resistance against third generation cephalosporins and fluoroquinolones are currently rarely observed among non-typhoidal salmonellae in the EU. The blaCMY-2 genes of the isolates were located on conjugative plasmids that could be transferred into an E. coli recipient strain. In two cases, a co-transfer of sul2 and tet(A), mediating resistance against sulfonamides and tetracycline, respectively, was observed. Overall the results of this study revealed that legally as well as illegally imported meat and meat products can harbor S. aureus, E. coli and Salmonella enterica isolates with multiple antimicrobial resistances and major virulence determinants. Many isolates differed genetically from isolates typically found on meat products in the EU and novel gene variants were identified in this study. In addition, several isolates showed unusual resistance phenotypes. As a result, infections or a colonization of persons with these resistant bacteria could occur. Furthermore, resistance determinants that are currently uncommon in the EU could be transferred to other bacteria via horizontal gene transfer. Consequently, international trade and the illegal transportation of meat and meat products could facilitate the spread of zoonotic pathogens and antimicrobial resistances over long distances.

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Müller, Anja: Molekulare Charakterisierung von Staphylococcus aureus, ESBL-/AmpC-bildenden Escherichia coli und Salmonella enterica aus legal und illegal aus Drittländern eingeführten Lebensmitteln. Hannover 2018. Tierärztliche Hochschule Hannover.

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