Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

”Search for biomarkers and pathogenesis studies in canine epilepsy”

Kostic, Draginja

Epilepsy is the most common chronic neurological disease in dogs. The aim of treatment is seizure freedom but cannot be achieved in many cases. Successful treatment is considered a useful decrease in seizure frequency. To improve the outcome, a constant search for new treatment strategies is performed, influencing either the disease or epileptogenesis. Biomarkers are needed in neuroscience to depict changes on cellular or molecular level within the brain’s specific microenvironment. Finding useful biomarkers in epilepsy could support the search for new therapeutic strategies. In the current thesis, we have evaluated two potential prognostic biomarkers, glial fibrillary acidic protein (GFAP) and interleukin-1β (IL-1β) and one receptor possibly involved in pathogenesis of canine epilepsy, the cannabinoid receptor type-1 (CB1R). In the first part of the study GFAP, the main intermediate filament protein in astrocytes, was evaluated as potential biomarker for intracranial disorders using an ELISA. Healthy beagles and dogs with the clinical diagnoses idiopathic epilepsy, brain tumor, inflammation, spinal cord injury (SCI) and traumatic brain injury (TBI) were included. Significant differences were found between GFAP CSF levels of dogs with tumor and epilepsy and between inflammatory diseases and epilepsy. Furthermore, in TBI patients, high serum GFAP levels had a strong correlation with the Glasgow Coma Scale score. In dogs with SCI no significant difference between chronic and acute cases and severity of clinical signs could be detected. The second part of the project focused on the possible involvement of IL-1β, a potent proinflammatory cytokine, in neuroinflammation in epilepsy. Levels of IL-1β in serum and CSF were measured using an ELISA and compared between healthy dogs and TBI and epilepsy patients. IL-1β concentrations in CSF were not detectable. Additionally, serum values were not elevated in dogs with TBI in comparison to healthy controls. However, dogs with epilepsy had increased levels of IL-1β in serum regardless of the underlying cause of the disease. In the last part of the study, we investigated the expression of CB1R in hippocampus of epileptic dogs and quantitatively compared it to control animals. For that purpose, brain tissues of control dogs, dogs with idiopathic and structural epilepsy were CB1R immunolabeled using immunohistochemistry and double immunofluorescence staining. Expression of CB1R was qualitatively and quantitatively evaluated in several regions of hippocampus. Moreover, the number of CB1R positive astrocytes in dentate gyrus (DG) was compared between the groups of animals. In epileptic dogs a disease associated reorganization of CB1R expression was observed. In dogs with idiopathic epilepsy the CB1R expression was significantly decreased in the CA1 region compared to controls. Conversely, hippocampus of dogs with structural epilepsy revealed a significant increase in CB1R staining intensity in comparison to controls. Comparison of idiopathic and structural tissue demonstrated that both, the immunopositive area and the optical density of the staining reached significantly higher levels in patients with structural epilepsy. In addition, about 50% of astrocytes displayed positive CB1R staining in the tissue examined. In the current search for different biomarkers in canine epilepsy, the most important findings were that GFAP levels in CSF reflect severe structural changes in the brain parenchyma and GFAP serum levels in TBI may predict the outcome; IL-1β in serum is increased in epilepsy independent of the etiology of the seizures; CB1R expression in canine hippocampus was increased in structural epilepsy and downregulated in idiopathic epilepsy patients and more than 50% of astrocytes expressed CB1R. These findings, especially the disease associated influences need to be considered, when further validating new treatment approaches for dogs with epilepsy.

Epilepsie ist eine der häufigsten chronischen neurologischen Erkrankungen bei Hunden. Idealerweise würde deren Behandlung zur vollständigen Anfallsfreiheit führen, was in vielen Fällen nicht erreicht wird. Daher wird als erfolgreiche Behandlung eine klinisch relevante Verringerung der Anfallshäufigkeit angesehen. Um Epilepsie besser behandeln zu können, sind neue Behandlungsstrategien notwendig, die entweder die Krankheit selber oder die Epileptogenese modifizieren. Biomarker werden besonders in den Neurowissenschaften benötigt, um Veränderungen auf zellulärer oder molekularer Ebene in der spezifischen Mikroumgebung des Gehirns darzustellen. Zuverlässige Biomarker zur Prognose oder Pathogenese der Epilepsie können dabei wesentlich zur Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze beitragen. Auf der Suche nach Biomarkern und um die Pathogenese der Epilepsie besser zu verstehen, haben wir zwei mögliche prognostische Biomarker, Glial Fibrillary Acid Protein (GFAP, saures Gliafaserprotein) und Interleukin-1β (IL-1β) und einen möglicherweise an der Pathogenese beteiligten Cannabinoid Rezeptor Typ-1 (CB1R) evaluiert. Im ersten Teil der Studie wurde GFAP, das wichtigste intermediäre Filamentprotein in Astrozyten, als potenzieller Biomarker für intrakranielle Störungen evaluiert. Gesunde Beagle und Hunde mit den klinischen Diagnosen idiopathische Epilepsie, Gehirntumor, Gehirnentzündung, Rückenmarkstrauma (SCI) und Schädel-Hirn-Trauma (TBI) wurden eingeschlossen. Signifikante Unterschiede wurden zwischen GFAP-CSF-Spiegeln bei Hunden mit Tumor und Epilepsie sowie zwischen entzündlichen Erkrankungen und Epilepsie gefunden. Darüber hinaus korrelierten hohe Serum-GFAP-Spiegel bei TBI-Patienten mit dem Glasgow Coma Scale Score. Bei Hunden mit SCI konnte kein signifikanter Unterschied zwischen chronischen und akuten Fällen und Schweregrad der klinischen Symptome festgestellt werden. Der zweite Teil des Projekts konzentrierte sich auf die mögliche Beteiligung von IL-1β, einem potenten proinflammatorischen Zytokin, bei der Neuroinflammation bei Epilepsie. Spiegel von IL-1β in Serum und CSF wurden zwischen gesunden Hunden und TBI- und Epilepsiepatienten verglichen. IL-1β-Konzentrationen waren im Liquor cerebrospinalis nicht nachweisbar. Außerdem waren die Serumwerte bei Hunden mit TBI im Vergleich zu gesunden Kontrollen nicht erhöht. Jedoch hatten Hunde mit Epilepsie einen erhöhten IL-1β-Spiegel im Serum, unabhängig von der zugrunde liegenden Ursache der Erkrankung. Im letzten Teil der Studie untersuchten wir die Expression von CB1R im Hippocampus von epileptischen Hunden und verglichen diese quantitativ mit Kontrolltieren. Zu diesem Zweck wurde Formalin fixiertes Hirngewebe von Kontrollhunden und Hunden mit idiopathischer und struktureller Epilepsie mittels Immunhistochemie und Doppelimmunfluoreszenzfärbung untersucht. Die Expression von CB1R wurde qualitativ und quantitativ in verschiedenen Regionen des Hippocampus evaluiert. Darüber hinaus wurde die Anzahl der CB1R-positiven Astrozyten im Gyrus dentatus zwischen den Tiergruppen verglichen. Bei Hunden mit Epilepsie kam es zu einer krankheitsabhängigen Reorganisation der CB1R Expression. Bei Hunden mit idiopathischer Epilepsie war die CB1R-Expression in der Cornu Ammonis 1-Region im Vergleich zu den Kontrollen signifikant verringert. Umgekehrt zeigte der Hippocampus von Hunden mit struktureller Epilepsie einen signifikanten Anstieg der Intensität der CB1R-Färbung im Vergleich zu den Kontrollen. Ein Vergleich von Gehirngewebe von Hunden mit idiopathischer und struktureller Epilepsie zeigte, dass sowohl der Bereich mit CB1R Expression als auch die optische Dichte der Färbung bei Patienten mit struktureller Epilepsie signifikant höhere Werte erreichten. Ca. 50% der Astrozyten wiesen in allen untersuchten Bereichen eine positive CB1R-Färbung auf. In vorliegender Studie waren die wichtigsten Befunde, dass GFAP-Werte im Liquor cerebrospinalis die Schwere struktureller Veränderungen im Parenchym unabhängig der Ursache der Läsion widerspiegeln und GFAP-Serumspiegel in TBI die Prognose vorhersagen könnten; IL-1β war im Serum bei Hunden mit Epilepsie unabhängig der Ursache für die Krampfanfälle erhöht; Die CB1R-Expression im Hippocampus von Hunden war bei struktureller Epilepsie erhöht, bei idiopathischer dagegen herunterreguliert. Diese krankheitsabhängigen Veränderungen sollten bei der Weiterentwicklung neuer Behandlungsansätze für Hunde mit Epilepsie berücksichtigt werden.

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Kostic, Draginja: ”Search for biomarkers and pathogenesis studies in canine epilepsy”. Hannover 2018. Tierärztliche Hochschule Hannover.

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