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In vivo and in vitro investigations on Bordetella avium infection in turkeys

Bordetella avium (BA) is a bacterial pathogen inducing respiratory disease in young turkeys. BA has a significant economic impact on turkey production worldwide and affects animal health and welfare. Knowledge about the pathogenesis of avian bordetellosis, control mechanisms against BA and virulence mechanisms is very limited. Preventive measures against the clinical disease induced by BA are restricted to general biosecurity measures and the application of vaccines, which have not yet proven to be reliable in protection of turkey flocks. Nevertheless, flock-specific autogenous vaccines are an important component of prevention strategies against BA-infection in European countries. Due to legal regulations, the pathogen has to be inactivated as a component of this type of vaccine. Consequently, the vaccine needs to be applied parenterally by individual injections to induce an effective immune resonse. The procedure of individual application has several disadvantages in commercial turkey husbandry: It is not only labor and cost intensive, but induces lesions in the skin and muscles at the application site of the vaccine and involves handling of the turkeys, which provokes stress reactions in the animals. On these grounds, the German Federal Ministry of Food and Agriculture funded a joint project with the goal of the “development of innovative flock-specific vaccines for simplified application” (InnoVak4DART), in which the two studies, which are included in the present thesis, were embedded. The aims of the first study (chapter 4), were to enhance the understanding of the pathogenesis of BA-infection and to establish a reliable in vivo model to test efficacy of BA-vaccines against BA-challenge. The objectives of the first experiment in the study were to investigate the effects of different dosages and inoculation routes on the pathogenesis of BA-infection and on the immune response to the pathogen. BA-pathogenesis was experimentally investigated in naïve turkeys, which were inoculated at the age of 28 days. The turkeys were either inoculated oculonasally with 105, 107 or 109 colony forming units (CFU) of BA per bird or exposed to BA by aerosol with 105–108 CFU/m3. The four differently inoculated groups and a BA-free control group were compared regarding the clinical signs, BA-colonisation pattern in choanae, tracheae and lungs and the humoral systemic and local BA-specific immune responses. In comparison to the oculonasally inoculated groups, aerosol inoculation led to higher prevalence and to delayed clearance of BA from the respiratory tract of the turkeys. Circulating BA-specific IgG was detected from five days post inoculation (pi) onwards and IgA in lacrimal fluid from seven days pi, regardless of the applied inoculation route and dose. In all groups, antibodies remained at a high level with a slightly downward tendency until the end of the experiment 21 days pi. The objective of the second experiment in the first study was to ascertain the reliability of the model for the evaluation of the efficacy of a vaccine against BA. 21-day-old turkeys were vaccinated with a formalin-inactivated BA-vaccine intramuscularly and challenged 21 days post vaccination (pv) with 107 CFU per bird oculonasally. BA-specific IgG antibodies were detected in serum as well as in lacrimal fluid at 14 days pv. No BA-specific IgA-antibodies were measured in lacrimal fluids. Vaccination induced partial protection against the pathogen. The tracheae of vaccinated animals were colonised with a significantly lower number of BA compared to the non-vaccinated animals (P ≤ 0.05). Consequently, the established model is suitable for vaccine efficacy testing even in the absence of clinical signs or pathological alterations. The aim of the second study of this project (chapter 5) was to characterise BA field strains regarding their virulence-associated properties and their putative virulence mechanisms. The first objective was the establishment of two in vitro assays in tracheal organ cultures (TOC) to characterise the strains regarding their ability to adhere to the tracheal epithelium and to induce ciliostasis. The second objective was to compare BA field strains regarding these virulence-associated properties in the established in vitro models. The third and fourth objectives of this study were to investigate genetic diversity of the included BA field strains and to identify possible genetic factors for reduced virulence-associated properties. In this study, we included 17 BA-strains, which had been isolated from several poultry flocks. Following inoculation of TOCs with 105 and 107 CFU/ml, three strains displayed a reduced ability to adhere to the tracheal epithelium compared to the other strains. Additionally, the ciliostasis assay demonstrated a significantly reduced and delayed ciliostatic effect after inoculation with these three strains for both inoculation doses compared to the other strains (P ≤ 0.05). The results demonstrate that BA field strains differ in their ability to adhere and to induce ciliostasis. The characteristics of adherence and ciliostasis were reproducible in experiments with two different inoculation dosages and the ability to adhere to the tracheal epithelium and to induce ciliostasis covaried. Core genome multilocus sequence typing (cgMLST) was performed to investigate the genetic diversity of the strains and to find out whether the strains with reduced virulence-associated properties are closely related to each other regarding their virulence-associated genes. Next generation sequencing data of 45 BA field strains, which had been gathered by our cooperative partners, and two published BA-genomes were used to develop a cgMLST scheme based on 2,667 targets of the reference genome, which was equivalent to 77,3 % of the complete genome. cgMLST analysis of the 17 investigated field strains demonstrated a genetic diversity in the BA field strains. A minimum spanning tree including 119 virulence-associated genes showed that the number of allele differences in these genes varied between one and 71. Most of the investigated strains formed a group with only one to 15 allelic differences in virulence-associated genes. The three strains with reduced virulence-associated properties were part of this group. A correlation between the sequence type data and the virulence-associated properties could not be detected with the available data. However, the cgMLST analysis together with amino acid sequence alignment suggest a potential candidate contributing to reduced virulence as strains with reduced virulence-associated properties had mutations in the putative Filamentous Hemagglutinin (FHA) protein. Mutations in that protein may modify the ability of the bacteria to adhere to the tracheal epithelium, to colonise the respiratory tract of turkeys and subsequently to induce pathological alterations. Overall, this work provides new insights into the pathogenesis of BA-infection in turkeys. It suggests that humoral immunity may play an important role in protection against the infection as antibody-positive birds showed reduced BA-colonisation of the respiratory tract. The knowledge about humoral protection against colonisation of the respiratory epithelia can be of relevance for the development of vaccine strategies. Additionally, we established a challenge model, which can be used for efficacy testing of innovative vaccines, which will be developed in the future. The challenge model can be modified for application of vaccines via different application routes, such as “eyedrop” (oculonasal application) or aerosolisation of vaccines. In addition, we could describe variations in virulence-associated properties and virulence-associated genes of BA field strains in vitro. These variations should be characterised in more detail in future studies, including their effect on variations in protein structure and protein function and their relevance for the virulence phenotype of the strains in vivo. This knowledge could possibly provide further opportunities for BA-vaccine development.

Bordetella avium (BA) ist ein bakterieller Erreger, der Atemwegserkrankungen bei jungen Puten auslöst. BA hat eine weltweite ökonomische Relevanz für die Putenproduktion und beeinträchtigt die Gesundheit und das Wohlbefinden der betroffenen Tiere. Bisher ist nur wenig bekannt über die Pathogenese der aviären Bordetellose, die Immunmechanismen zur Kontrolle der BA-Infektion und die Virulenzmechanismen. Präventionsmaßnahmen beschränken sich auf generelle Biosicherheitsmaßnahmen und die Anwendung von Impfstoffen, deren Wirksamkeit aber bislang noch nicht eindeutig bewiesen werden konnte. Trotzdem sind in europäischen Ländern bestandsspezifische autogene Impfstoffe ein wichtiger Teil der Präventionsstrategie gegen BA-Infektionen. Aufgrund rechtlicher Vorgaben muss das Pathogen als Bestandteil dieser Vakzinen inaktiviert werden. Daher müssen die Impfstoffe parenteral über individuelle Injektionen verabreicht werden um eine effektive Immunantwort hervorrufen zu können. Dieses Verfahren der individuellen Applikation hat einige Nachteile in kommerziellen Putenhaltungen: Es ist nicht nur arbeits- und kostenintensiv, sondern verursacht auch Läsionen in der Haut und der Muskulatur am Applikationsort und setzt das Fangen und Fixieren der Puten voraus, was Stressreaktionen der Tiere auslösen kann. Aus diesen Gründen förderte das Deutsche Bundesministerium für Ernährung und Landwirtschaft ein Verbundprojekt mit dem Ziel der „Entwicklung innovativer bestandsspezifischer Vakzine zur vereinfachten Applikation beim Geflügel“ (InnoVak4DART). In dieses Verbundprojekt waren die beiden Studien eingebettet, die in der vorliegenden These enthalten sind. Die Ziele der ersten Studie (Kapitel 4) waren, das Verständnis der Pathogenese der BA-Infektion zu verbessern und ein verlässliches in vivo-Modell zur Wirksamkeitsprüfung von BA-Impfstoffen gegen eine BA-Belastungsinfektion zu etablieren. Gegenstand des ersten Experiments der Studie war die Erforschung der Effekte verschiedener Infektionsdosen und –routen auf die Pathogenese der BA-Infektion und die Immunantwort auf den Erreger. Die Pathogenese von BA wurde experimentell in naiven Puten untersucht, die im Alter von 28 Tagen mit BA inokuliert wurden. Die Puten wurden entweder okulonasal mit einer Dosis von 105, 107 oder 109 koloniebildenden Einheiten (KBE) pro Tier inokuliert, oder über eine Dauer von 30 min einem mit BA versetzten Aerosol (105-108 KBE/m³) ausgesetzt. Die vier unterschiedlich behandelten Gruppen und eine BA-freie Kontrollgruppe wurden bezüglich ihrer klinischen Symptomatik, der BA-Besiedlung von Choane, Trachea und Lunge und der BA-spezifischen humoralen systemischen und lokalen Immunantwort verglichen. Im Vergleich zu der okulonasalen Inokulation führte die Inokulation per Aerosol zu einer höheren BA-Prävalenz und einer verzögerten BA-Clearance des Respirationstraktes der Puten. Zirkulierendes BA-spezifisches IgG wurde ab dem fünften Tag nach Inokulation nachgewiesen und IgA ab dem siebten Tag nach Inokulation in der Tränenflüssigkeit. Dies war unabhängig vom jeweiligen Infektionsweg und der Infektionsdosis. In allen Gruppen blieben die Antikörper bis zum Ende des Experiments, 21 Tage nach Infektion, auf einem hohen Niveau mit leicht abnehmender Tendenz. Gegenstand des zweiten Experiments der ersten Studie war eine Bewertung der Verlässlichkeit des Modells für die Evaluation der Wirksamkeit eines BA-Impfstoffes. Puten wurden im Alter von 21 Tagen mit einem formalin-inaktivierten BA-Impfstoff intramuskulär geimpft und 21 Tage nach Impfung einer okulonasalen Belastungsinfektion mit 107 KBE pro Vogel ausgesetzt. Eine humorale Immunantwort auf die Impfung konnte 14 Tage nach der Applikation des Impfstoffes in Form von BA-spezifischen IgG-Antikörpern im Serum und in der Tränenflüssigkeit nachgewiesen werden, während in der Tränenflüssigkeit keine BA-spezifischen IgA-Antikörper gemessen wurden. Trotzdem induzierte die Impfung einen teilweisen Schutz gegen den Erreger, was durch die quantitative Analyse der BA-Besiedlung der Trachea nach der Belastungsinfektion nachgewiesen werden konnte. Die Besiedlung der Trachea geimpfter Tiere war signifikant geringer als die der nicht geimpften Tiere (P ≤ 0.05). Folglich ermöglicht dieses Infektionsmodell, die Wirksamkeit eines Impfstoffes auch ohne die Induktion klinischer Symptome oder pathologischer Veränderungen zu beurteilen Das Ziel der zweiten Studie dieses Dissertationsprojektes (Kapitel 5) war die Charakterisierung von BA Feldstämmen in Bezug auf ihre virulenz-assoziierten Eigenschaften und ihre möglichen Virulenzmechanismen. Dazu wurden zwei in vitro Versuchsansätze in Tracheal-Organ-Kulturen (TOK) etabliert, um die Fähigkeit am Trachealepithel zu adhärieren und die Ziliaraktivität zu hemmen zu untersuchen. Zweites Arbeitsziel war es, BA Feldstämme hinsichtlich dieser virulenz-assoziierten Eigenschaften in den etablierten in vitro Modellen zu vergleichen. Drittens und viertens sollte die genetische Diversität der untersuchten BA-Feldstämme untersucht werden und mögliche genetische Faktoren für reduzierte virulenz-assoziierte Eigenschaften identifiziert werden. In diese Studie wurden 17 BA-Stämme aufgenommen, die aus verschiedenen Geflügelbeständen isoliert worden waren. Nach einer Inokulation der TOK mit 105 und 107 KBE/ml zeigten drei Stämme eine verringerte Adhäsionsfähigkeit. Zusätzlich zeigte der Ziliostase Assay, dass die drei Stämme unter Verwendung beider Inokulationsdosen auch einen signifikant verminderten oder verspäteten ziliostatischen Effekt im Vergleich zu den anderen Stämmen besaßen (P ≤ 0.05). Die Eigenschaften von Adhäsion und Ziliostase waren reproduzierbar in Versuchen mit zwei verschiedenen Inokulationsdosen und die Fähigkeit zu adhärieren und die Ziliaraktivität zu hemmen kovariierten. Zur Untersuchung der genetischen Diversität der Stämme und um der Frage nachzugehen, ob die Stämme mit reduzierten virulenz-assoziierten Eigenschaften eine enge Verwandtschaft ihrer virulenz-assoziierten Gene aufweisen, wurde ein core genome multilocus sequence typing (cgMLST) durchgeführt. Daten aus Next generation Sequencing von 45 BA-Feldstämmen, die von unseren Kooperationspartnern erhoben wurden, und zwei bereits veröffentlichten BA-Genomen wurden für die Entwicklung eines cgMLST-Schemas genutzt. Dieses beinhaltete 2.667 Zielbereiche des Referenzgenoms, was 77,3% des gesamten Genoms entspricht. Die cgMLST-Analyse der 17 untersuchten Stämme zeigte eine genetische Diversität der BA Feldstämme. Ein minimum spanning tree, der anhand von 119 virulenz-assoziierten Genen erstellt wurde zeigte, dass die Anzahl der Allelunterschiede in diesen Genen zwischen einzelnen benachbarten Stämmen zwischen einem und 71 Allelen liegt. Die meisten der untersuchten Stämme bildeten eine Gruppe mit nur einem bis 15 Allelunterschieden in den virulenz-assoziierten Genen. In dieser Gruppe befanden sich auch die drei Stämme mit reduzierten virulenz-assoziierten Eigenschaften. Eine Korrelation zwischen den Sequenztyp-Daten und den virulenz-assoziieten Eigenschaften konnte anhand der verfügbaren Daten nicht festgestellt werden. Allerdings erlaubte die cgMLST-Analyse zusammen mit einem Aminosäuresequenz-Alignment die Spekulation über einen potenziellen Faktor der möglicherweise zu den reduzierten virulenz-assoziierten Eigenschaften beigetragen haben könnte, da alle Stämme mit reduzierten virulenz-assoziierten Eigenschaften Mutationen im mutmaßlichen Filamentösen Haemagglutinin (FHA) Protein aufwiesen. Mutationen in diesem Protein könnten die Fähigkeit der Bakterien zur Adhärenz, zur Besiedlung des Respirationstraktes und folglich zur Verursachung pathologischer Veränderungen beeinflussen. Somit bietet diese Arbeit neue Einblicke in die Pathogenese der BA-Infektion der Pute. Sie weist auf eine möglicherweise wichtige Rolle der humoralen Immunantwort im Schutz gegen die Infektion hin, da antikörper-positive Vögel eine reduzierte BA-Besiedlung des Respirationstraktes zeigten. Das Wissen über den humoralen Schutz gegen die Besiedlung der respiratorischen Epithelien kann für die Entwicklung neuer Impfstrategien von Bedeutung sein. Wir konnten außerdem ein Infektionsmodell etablieren, das für die Wirksamkeitsprüfung innovativer Impfstoffe genutzt werden kann, die in Zukunft entwickelt werden. Das Belastungsmodell kann für verschiedene Applikationsarten von Impfstoffen, wie zum Beispiel „Augentropfen“ (okulonasale Applikation) oder Versprühen von Impfstoffen modifiziert werden. Zusätzlich konnten wir Variationen in den virulenz-assoziierten Eigenschaften in vitro und den virulenz-assoziierten Genen von BA Feldstämmen beschreiben. Diese Variationen sollten in zukünftigen Studien weiter charakterisiert werden, einschließlich ihres Effekts auf die Proteinstruktur und –funktion und auf den Virulenz-Phänotyp der Stämme in vivo. Dieses Wissen könnte weitere Möglichkeiten für die BA-Impfstoffentwicklung eröffnen.



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