In vivo and in vitro investigations on Bordetella avium infection in turkeys

Bordetella avium (BA) ist ein bakterieller Erreger, der Atemwegserkrankungen bei jungen Puten auslöst. BA hat eine weltweite ökonomische Relevanz für die Putenproduktion und beeinträchtigt die Gesundheit und das Wohlbefinden der betroffenen Tiere. Bisher ist nur wenig bekannt über die Pathogenese der aviären Bordetellose, die Immunmechanismen zur Kontrolle der BA-Infektion und die Virulenzmechanismen. Präventionsmaßnahmen beschränken sich auf generelle Biosicherheitsmaßnahmen und die Anwendung von Impfstoffen, deren Wirksamkeit aber bislang noch nicht eindeutig bewiesen werden konnte. Trotzdem sind in europäischen Ländern bestandsspezifische autogene Impfstoffe ein wichtiger Teil der Präventionsstrategie gegen BA-Infektionen. Aufgrund rechtlicher Vorgaben muss das Pathogen als Bestandteil dieser Vakzinen inaktiviert werden. Daher müssen die Impfstoffe parenteral über individuelle Injektionen verabreicht werden um eine effektive Immunantwort hervorrufen zu können. Dieses Verfahren der individuellen Applikation hat einige Nachteile in kommerziellen Putenhaltungen: Es ist nicht nur arbeits- und kostenintensiv, sondern verursacht auch Läsionen in der Haut und der Muskulatur am Applikationsort und setzt das Fangen und Fixieren der Puten voraus, was Stressreaktionen der Tiere auslösen kann. Aus diesen Gründen förderte das Deutsche Bundesministerium für Ernährung und Landwirtschaft ein Verbundprojekt mit dem Ziel der „Entwicklung innovativer bestandsspezifischer Vakzine zur vereinfachten Applikation beim Geflügel“ (InnoVak4DART). In dieses Verbundprojekt waren die beiden Studien eingebettet, die in der vorliegenden These enthalten sind. Die Ziele der ersten Studie (Kapitel 4) waren, das Verständnis der Pathogenese der BA-Infektion zu verbessern und ein verlässliches in vivo-Modell zur Wirksamkeitsprüfung von BA-Impfstoffen gegen eine BA-Belastungsinfektion zu etablieren. Gegenstand des ersten Experiments der Studie war die Erforschung der Effekte verschiedener Infektionsdosen und –routen auf die Pathogenese der BA-Infektion und die Immunantwort auf den Erreger. Die Pathogenese von BA wurde experimentell in naiven Puten untersucht, die im Alter von 28 Tagen mit BA inokuliert wurden. Die Puten wurden entweder okulonasal mit einer Dosis von 105, 107 oder 109 koloniebildenden Einheiten (KBE) pro Tier inokuliert, oder über eine Dauer von 30 min einem mit BA versetzten Aerosol (105-108 KBE/m³) ausgesetzt. Die vier unterschiedlich behandelten Gruppen und eine BA-freie Kontrollgruppe wurden bezüglich ihrer klinischen Symptomatik, der BA-Besiedlung von Choane, Trachea und Lunge und der BA-spezifischen humoralen systemischen und lokalen Immunantwort verglichen. Im Vergleich zu der okulonasalen Inokulation führte die Inokulation per Aerosol zu einer höheren BA-Prävalenz und einer verzögerten BA-Clearance des Respirationstraktes der Puten. Zirkulierendes BA-spezifisches IgG wurde ab dem fünften Tag nach Inokulation nachgewiesen und IgA ab dem siebten Tag nach Inokulation in der Tränenflüssigkeit. Dies war unabhängig vom jeweiligen Infektionsweg und der Infektionsdosis. In allen Gruppen blieben die Antikörper bis zum Ende des Experiments, 21 Tage nach Infektion, auf einem hohen Niveau mit leicht abnehmender Tendenz. Gegenstand des zweiten Experiments der ersten Studie war eine Bewertung der Verlässlichkeit des Modells für die Evaluation der Wirksamkeit eines BA-Impfstoffes. Puten wurden im Alter von 21 Tagen mit einem formalin-inaktivierten BA-Impfstoff intramuskulär geimpft und 21 Tage nach Impfung einer okulonasalen Belastungsinfektion mit 107 KBE pro Vogel ausgesetzt. Eine humorale Immunantwort auf die Impfung konnte 14 Tage nach der Applikation des Impfstoffes in Form von BA-spezifischen IgG-Antikörpern im Serum und in der Tränenflüssigkeit nachgewiesen werden, während in der Tränenflüssigkeit keine BA-spezifischen IgA-Antikörper gemessen wurden. Trotzdem induzierte die Impfung einen teilweisen Schutz gegen den Erreger, was durch die quantitative Analyse der BA-Besiedlung der Trachea nach der Belastungsinfektion nachgewiesen werden konnte. Die Besiedlung der Trachea geimpfter Tiere war signifikant geringer als die der nicht geimpften Tiere (P ≤ 0.05). Folglich ermöglicht dieses Infektionsmodell, die Wirksamkeit eines Impfstoffes auch ohne die Induktion klinischer Symptome oder pathologischer Veränderungen zu beurteilen Das Ziel der zweiten Studie dieses Dissertationsprojektes (Kapitel 5) war die Charakterisierung von BA Feldstämmen in Bezug auf ihre virulenz-assoziierten Eigenschaften und ihre möglichen Virulenzmechanismen. Dazu wurden zwei in vitro Versuchsansätze in Tracheal-Organ-Kulturen (TOK) etabliert, um die Fähigkeit am Trachealepithel zu adhärieren und die Ziliaraktivität zu hemmen zu untersuchen. Zweites Arbeitsziel war es, BA Feldstämme hinsichtlich dieser virulenz-assoziierten Eigenschaften in den etablierten in vitro Modellen zu vergleichen. Drittens und viertens sollte die genetische Diversität der untersuchten BA-Feldstämme untersucht werden und mögliche genetische Faktoren für reduzierte virulenz-assoziierte Eigenschaften identifiziert werden. In diese Studie wurden 17 BA-Stämme aufgenommen, die aus verschiedenen Geflügelbeständen isoliert worden waren. Nach einer Inokulation der TOK mit 105 und 107 KBE/ml zeigten drei Stämme eine verringerte Adhäsionsfähigkeit. Zusätzlich zeigte der Ziliostase Assay, dass die drei Stämme unter Verwendung beider Inokulationsdosen auch einen signifikant verminderten oder verspäteten ziliostatischen Effekt im Vergleich zu den anderen Stämmen besaßen (P ≤ 0.05). Die Eigenschaften von Adhäsion und Ziliostase waren reproduzierbar in Versuchen mit zwei verschiedenen Inokulationsdosen und die Fähigkeit zu adhärieren und die Ziliaraktivität zu hemmen kovariierten. Zur Untersuchung der genetischen Diversität der Stämme und um der Frage nachzugehen, ob die Stämme mit reduzierten virulenz-assoziierten Eigenschaften eine enge Verwandtschaft ihrer virulenz-assoziierten Gene aufweisen, wurde ein core genome multilocus sequence typing (cgMLST) durchgeführt. Daten aus Next generation Sequencing von 45 BA-Feldstämmen, die von unseren Kooperationspartnern erhoben wurden, und zwei bereits veröffentlichten BA-Genomen wurden für die Entwicklung eines cgMLST-Schemas genutzt. Dieses beinhaltete 2.667 Zielbereiche des Referenzgenoms, was 77,3% des gesamten Genoms entspricht. Die cgMLST-Analyse der 17 untersuchten Stämme zeigte eine genetische Diversität der BA Feldstämme. Ein minimum spanning tree, der anhand von 119 virulenz-assoziierten Genen erstellt wurde zeigte, dass die Anzahl der Allelunterschiede in diesen Genen zwischen einzelnen benachbarten Stämmen zwischen einem und 71 Allelen liegt. Die meisten der untersuchten Stämme bildeten eine Gruppe mit nur einem bis 15 Allelunterschieden in den virulenz-assoziierten Genen. In dieser Gruppe befanden sich auch die drei Stämme mit reduzierten virulenz-assoziierten Eigenschaften. Eine Korrelation zwischen den Sequenztyp-Daten und den virulenz-assoziieten Eigenschaften konnte anhand der verfügbaren Daten nicht festgestellt werden. Allerdings erlaubte die cgMLST-Analyse zusammen mit einem Aminosäuresequenz-Alignment die Spekulation über einen potenziellen Faktor der möglicherweise zu den reduzierten virulenz-assoziierten Eigenschaften beigetragen haben könnte, da alle Stämme mit reduzierten virulenz-assoziierten Eigenschaften Mutationen im mutmaßlichen Filamentösen Haemagglutinin (FHA) Protein aufwiesen. Mutationen in diesem Protein könnten die Fähigkeit der Bakterien zur Adhärenz, zur Besiedlung des Respirationstraktes und folglich zur Verursachung pathologischer Veränderungen beeinflussen. Somit bietet diese Arbeit neue Einblicke in die Pathogenese der BA-Infektion der Pute. Sie weist auf eine möglicherweise wichtige Rolle der humoralen Immunantwort im Schutz gegen die Infektion hin, da antikörper-positive Vögel eine reduzierte BA-Besiedlung des Respirationstraktes zeigten. Das Wissen über den humoralen Schutz gegen die Besiedlung der respiratorischen Epithelien kann für die Entwicklung neuer Impfstrategien von Bedeutung sein. Wir konnten außerdem ein Infektionsmodell etablieren, das für die Wirksamkeitsprüfung innovativer Impfstoffe genutzt werden kann, die in Zukunft entwickelt werden. Das Belastungsmodell kann für verschiedene Applikationsarten von Impfstoffen, wie zum Beispiel „Augentropfen“ (okulonasale Applikation) oder Versprühen von Impfstoffen modifiziert werden. Zusätzlich konnten wir Variationen in den virulenz-assoziierten Eigenschaften in vitro und den virulenz-assoziierten Genen von BA Feldstämmen beschreiben. Diese Variationen sollten in zukünftigen Studien weiter charakterisiert werden, einschließlich ihres Effekts auf die Proteinstruktur und –funktion und auf den Virulenz-Phänotyp der Stämme in vivo. Dieses Wissen könnte weitere Möglichkeiten für die BA-Impfstoffentwicklung eröffnen.