Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Interaktion zwischen verschiedenen Vitamin-D-Metaboliten und Mechanismen zur Metabolisierung und Elimination von Xenobiotika bei der RatteInteraction between different vitamin D metabolites and mechanisms for metabolism and elimination of xenobiotics in rats

Klumpp, Karoline

Die Bedeutung von Vitamin D wird zurzeit kontrovers diskutiert. Während die Rolle von Vitamin D für die Aufrechterhaltung der Calcium-Homöostase unumstritten ist, konnten in den letzten Jahren weitere positive Wirkungen, beispielsweise in Bezug auf die Immunfunktion, aufgezeigt werden. Allerdings konnten inzwischen auch Hinweise darauf gefunden werden, dass Vitamin D die Pharmakokinetik von Medikamenten beeinflussen kann. Da die Ergebnisse dieser in der Regel unter Verwendung von sehr hohen Dosierungen durchgeführten Arbeiten an Schafen, Labornagern und Zellkulturen zum Teil widersprüchlich sind, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit der Frage nachgegangen, ob Ratten prinzipiell anders reagieren als Schafe, oder ob die beobachteten Unterschiede auf die Dosierung und Applikationsroute zurückzuführen sind. Hierzu wurde Ratten Vitamin D3, 25-Hydroxycholecalciferol (25‑OHD3) oder 1,25-Dihydroxycholecalciferol (1,25-(OH)2D3) in bereits experimentell oder therapeutisch an Schafen und Rindern eingesetzten Dosierungen verabreicht. Um den direkten Einfluss der Behandlungen auf den Vitamin-D-Metabolismus zu untersuchen, wurden 25-OHD3, 1,25-(OH)2D2/3, 24,25-OHD3 und Gesamtcalcium im Serum sowie die RNA-Expression der für den Vitamin-D-Metabolismus wichtigen Enzyme Cytochrom P450 (CYP) 27B1 und CYP24A1 und relevante Calcium-Transportproteine bestimmt. Der Einfluss der Vitamin-D-Metaboliten auf die Metabolisierung und Elimination von Xenobiotika wurde anhand ausgewählter Enzyme und Transporter in der Leber, der Niere sowie im proximalen und distalen Jejunum näher charakterisiert. Die Efflux-Pumpe P-Glykoprotein (P-gp) sowie die Enzyme CYP3A9, CYP3A18 und CYP3A62 wurden auf Transkriptions- und Translationsebene durch quantitative RT‑PCR und Western Blot untersucht. Darüber hinaus wurde die RNA-Expression des Organic Anion Transporter (OAT) 3 und der Kernrezeptoren Pregnan X Rezeptor (PXR) und Vitamin D Rezeptor (VDR) quantifiziert. Außerdem erfolgte die funktionelle Untersuchung der P-gp-Aktivität mittels Ussing-Kammer-Technik. Die Serumkonzentration von 25-OHD3 stieg bei den mit 25-OHD3 und Vitamin D3 behandelten Tieren und die Serumkonzentration von 1,25-(OH)2D3 und Calcium bei der 1,25-(OH)2D3 behandelten Gruppe signifikant an, wodurch der Erfolg der Behandlung bestätigt werden konnte. Bei der mit 1,25-(OH)2D3 behandelten Gruppe konnte ein Anstieg der CYP24A1-, sowie ein Absinken der CYP27B1-RNA-Expression als Gegenregulation nachgewiesen werden. Calbindin-D9k, als wichtiges Calcium-Bindungsprotein in den jejunalen Enterozyten, zeigte einen Anstieg der Expression nach der 1,25-(OH)2D3-Behandlung. Bei den an der Metabolisierung und Elimination von Xenobiotika beteiligten Enzymen konnte bei der 1,25-(OH)2D3 behandelten Gruppe ein Abfall der RNA-Expression von CYP3A9 im distalen Jejunum, CYP3A18 und PXR in der Leber sowie PXR in der Niere nachgewiesen werden. Zudem konnte ein RNA-Expressionsanstieg des renalen VDR beobachtet werden. Nach der 25‑OHD3-Behandlung wurde in der RNA-Expression keine Veränderung nachgewiesen. Die mit Vitamin D3 behandelte Gruppe zeigte in der Niere einen Abfall in der RNA-Expression von PXR. Es wurden in einigen behandelten und unbehandelten Gruppen Korrelationen im proximalen Jejunum zwischen der RNA-Expression von PXR und CYP3A18, PXR und CYP3A62 und PXR und MDR1a nachgewiesen. Zudem konnte in der Leber eine Korrelation zwischen der RNA-Expression von PXR und MDR1a in einigen Gruppen dargestellt werden. Bei den 25-OHD3 und Vitamin D3 behandelten Gruppen wurden Korrelationen zwischen P-gp und der 25-OHD3-Serumkonzentration gezeigt. Zudem wurde bei diesen beiden Behandlungsgruppen in der Ussing-Kammer eine verstärkte Inhibition von P-gp durch Verapamil beobachtet. In dieser Studie konnten durch die Behandlung mit Vitamin-D-Metaboliten Veränderungen in der Expression von Enzymen und Kernrezeptoren, die an der Metabolisierung und Elimination von Xenobiotika beteiligt sind, gezeigt werden. Dass die vorwiegend verminderte Expression von Enzymen und Kernrezeptoren einen Einfluss auf die Funktionalität hat und damit Einfluss auf die Metabolisierung und Elimination von Xenobiotika, konnte zumindestens anhand der Ussing-Kammer beim Transporter P-gp nicht bestätigt werden. Zudem können weder die hier aufgeführten Studien an Ratten noch die an Schafen im vollen Umfang bestätigt werden, denn die Dosierungen, die Applikationsrouten und die Tierart scheinen sowohl beim Vitamin‑D‑Metabolismus als auch bei der Interaktion zwischen Vitamin-D-Metaboliten und Mechanismen zur Metabolisierung und Elimination von Xenobiotika wichtig zu sein.

The importance of vitamin D is currently the subject of controversial debate. While the role of vitamin D for the maintenance of calcium homeostasis is undisputed, further positive effects, for example immune function, have been demonstrated in recent years. However, evidence has since been found that vitamin D can influence the pharmacokinetics of drugs. Since the results of this work on sheep, laboratory rodents and cell cultures, which is usually carried out using very high doses, are in part contradictory, the present work investigated whether rats react in principle differently from sheep or whether the differences observed are due to the dosage and application route. For this purpose, rats were given vitamin D3, 25-hydroxycholecalciferol (25‑OHD3) or 1,25-dihydroxycholecalciferol (1,25-(OH)2D3) in doses already used experimentally or therapeutically in sheep and cattle. To investigate the direct influence of the treatments on vitamin D metabolism, 25‑OHD3, 1,25-(OH)2D2/3, 24,25-OHD3 and total calcium in serum and the RNA expression of the enzymes cytochrome P450 (CYP) 27B1 and CYP24A1 and relevant calcium transport proteins important for vitamin D metabolism were determined. The influence of vitamin D metabolites on the metabolism and elimination of xenobiotics was characterized in more detail using selected enzymes and transporters in the liver, kidney, proximal and distal jejunum. The efflux pump P-glycoprotein (P-gp) and the enzymes CYP3A9, CYP3A18 and CYP3A62 were examined at transcription and translation level by quantitative RT-PCR and western blot. Further, the RNA expression of the organic anion transporter (OAT) 3 and the nuclear receptors pregnane X receptor (PXR) and vitamin D receptor (VDR) were quantified. In addition, the functional investigation of P‑gp activity was performed using the Ussing chamber technique. The serum concentration of 25-OHD3 increased significantly in animals treated with 25-OHD3 and vitamin D3 and the serum concentration of 1,25-(OH)2D3 and calcium in the 1,25-(OH)2D3 treated group, confirming the success of the treatment. In the group treated with 1,25-(OH)2D3, an increase in CYP24A1 expression and a decrease in CYP27B1 RNA expression were observed as counter-regulation. Calbindin-D9k, as an important calcium binding protein in the jejunal enterocytes, showed an increase in expression after 1,25-(OH)2D3 treatment. In the enzymes involved in the metabolism and elimination of xenobiotics, a decrease in RNA expression of CYP3A9 in the distal jejunum, CYP3A18 and PXR in the liver and PXR in the kidney was detected in the 1,25-(OH)2D3 treated group. In addition, an increase in RNA expression of renal VDR was observed. No change in RNA expression was detected after 25-OHD3 treatment. The vitamin D3 treated group showed a decrease in the renal RNA expression of PXR. Proximal jejunum correlations between RNA expression of PXR and CYP3A18, PXR and CYP3A62 and PXR and MDR1a in some treated and untreated groups were detected. Further, a correlation between the RNA expression of PXR and MDR1a could be shown in the liver in some groups. In the 25-OHD3 and vitamin D3 groups treated, correlations between P-gp and 25‑OHD3 serum concentration were shown. In addition, increased inhibition of P-gp by verapamil was observed in these two treatment groups in the Ussing chamber. In this study, changes in the expression of enzymes and nuclear receptors involved in the metabolism and elimination of xenobiotics were shown by treatment with vitamin D metabolites. The fact that the predominantly reduced expression of enzymes and nuclear receptors has an influence on functionality and thus on the metabolism and elimination of xenobiotics could not be confirmed at least by the Ussing chamber in the P-gp transporter. Moreover, neither the studies in rats nor those in sheep listed here can be fully confirmed, because the dosages, the application routes and the species seem to be important both in vitamin D metabolism and in the interaction between vitamin D metabolites and mechanisms for the metabolism and elimination of xenobiotics.

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Klumpp, Karoline: Interaktion zwischen verschiedenen Vitamin-D-Metaboliten und Mechanismen zur Metabolisierung und Elimination von Xenobiotika bei der RatteInteraction between different vitamin D metabolites and mechanisms for metabolism and elimination of xenobiotics in rats. Hannover . Tierärztliche Hochschule Hannover.

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