Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Nanosilberbeschichtete Lebensmittelverpackungsfolie zur Reduktion von Keimen auf Schweinefleisch und Testung der Empfindlichkeit von MRSA- und MSSA-Isolaten gegenüber Silber und sieben weiteren Bioziden

Kernberger-Fischer, Isa Adriana

Wie Studien belegen, lassen sich auch MRSA auf Schweinefleisch nachweisen. Es besteht also die Möglichkeit, dass vor allem rohes Fleisch als Vektor für eine Transmission von MRSA zwischen Tier und Mensch fungiert. Während Silber schon seit langem in der Medizin Anwendung findet, wird der Einsatz von Nanosilber in Lebensmittelkontaktmaterialien zur Keimreduktion auf Lebensmitteln und zur Haltbarkeitsverlängerung kontrovers diskutiert. Ziel der vorliegenden Studie war es, zunächst die Empfindlichkeit von humanen und tierischen MRSA- und MSSA-Isolaten gegenüber Silbernitrat und sieben weiteren Bioziden zu überprüfen. Anschließend sollten die Effekte einer mit Nanosilber beschichteten Folie auf verschiedene mikrobiologische und physikochemische Fleischparameter von verpacktem Schweinefleisch in einem Lagerungsversuch untersucht werden. In zusätzlichen Versuchen wurde die gezielte Wirkung der mit Nanosilber beschichteten Folie auf mit MRSA inokuliertes Schweinfleisch in einem weiteren Lagerversuch eruiert. Die Empfindlichkeitstestung von MRSA und MSSA-Isolaten humaner und tierischer Herkunft wurde mittels Bouillon-Mikrodilution durchgeführt. Hierbei wurden die Minimalen Hemmkonzentrationswerte (MHK-Werte) für Alkyldiaminoethylglycinhydrochlorid, Benzethoniumchlorid, Benzalkoniumchlorid, Chlorhexidin, Acriflavin, Kupfersulfat, Silbernitrat und Zinkchlorid bestimmt. Zudem wurden Isolate mit erhöhten MHK-Werten auf das Vorhandensein Toleranz vermittelnder Gene (lmrS, mepA, norA, sepA, qacA/B, qacG, qacH, qacJ, smr, copA, mco und czrC) untersucht. Die statistische Analyse zeigte, dass es keine signifikanten Unterschiede der MHK-Werte zwischen Isolaten tierischer und humaner Herkunft, sowie zwischen Isolaten von kolonisierten und erkrankten Wirten gab. Gegenüber Silbernitrat zeigte sich für die getesteten MSSA- und MRSA-Isolate ein relativ enges, unimodales Verteilungsmuster der MHK-Werte. Isolate mit verminderter Empfindlichkeit wurden nicht beobachtet. Innerhalb der CC398-Isolate wurden für humane Isolate aber tendenziell höhere MHK-Werte gegenüber Silbernitrat im Vergleich zu den animalen Isolaten ermittelt. Darüber hinaus wiesen CC5-Isolate signifikant höhere MHK-Werte gegenüber Silbernitrat auf als CC22-Isolate. Für die zusätzlich untersuchten Biozide Acriflavin, Alkyldiaminoethylglycinhydrochlorid, Benzethoniumchlorid, Chlorhexidin und Kupfersulfat wurden ebenfalls unimodale, aber deutlich breitere Verteilungsmuster sichtbar. Eine bimodale Verteilung der MHK-Werte für Benzalkoniumchlorid und Zinkchlorid lieferte Hinweise auf eine tolerantere Subpopulation der MRSA/MSSA. Nur für Acriflavin, Benzethoniumchlorid, Benzalkoniumchlorid und Chlorhexidin wurden signifikante Unterschiede der MHK-Werte unterschiedlicher klonaler Linien beobachtet. Bei Isolaten mit erhöhten MHK-Werten für Quartäre Ammoniumverbindungen, Acriflavin und Chlorhexidin wurden vorwiegend die Gene lmrS, sepA und norA detektiert, während die Gene qacA/B, qacG, qacJ und smr nur vereinzelt nachzuweisen waren. Für Isolate mit erhöhten MHK-Werten für Kupfersulfat und Zinkchlorid wurden die Gene mco, copA und czrC nachgewiesen. Die statistische Analyse, die als Vergleichsgruppe eine Auswahl an Isolaten mit niedrigen MHK-Werten einschloss, konnte jedoch keinen Zusammenhang zwischen Genpräsenz und verminderter Empfindlichkeit von Isolaten offenlegen. Anschließend wurden in Verpackungsversuchen Schweineschnitzel in vier unterschiedlichen Verpackungsvarianten über eine Dauer von 12 Tagen gelagert. Bei den vier unterschiedlichen Verpackungsvarianten handelte es sich um: Schutzgasatmosphäre (80% O2 + 20% CO2) mit Kontrollfolie (MAP 1), Vakuum mit Kontrollfolie (V 1), Schutzgasatmosphäre mit Nanosilberfolie (MAP 2) und Vakuum mit Nanosilberfolie (V 2). In einem sich anschließenden Versuch wurden Schweineschnitzel mit MRSA inokuliert und mit direktem Kontakt zur Nanosilberfolie bzw. zur Kontrollfolie über 8 Tage gelagert. Hinsichtlich des Folientyps zeigten sich während der Lagerung nur vereinzelt signifikante Effekte der Nanosilberfolie. Zum einen wurden für das Fleisch an Tag 4 in den Verpackungen V 1 und MAP 1 signifikant höhere L*-Werte als für Schnitzel in V 2- und MAP 2-Verpackungen ermittelt. Deutlichere Ergebnisse wurden für die Anteile der Myoglobinredoxformen nachgewiesen. Für die Verpackungsvarianten mit Nanosilber wurden an den Tagen 4 und 12 signifikant höhere und an Tag 8 signifikant niedrigere OxyMb-Anteile nachgewiesen. Im Gegensatz dazu wurden für die Verpackungsvarianten V 2 und MAP 2 an den Tagen 4 und 12 signifikant niedrigere MetMb- und DeoxyMb-Anteile ermittelt, während an Tag 8 der gegenteilige Effekt beobachtet wurde. Demgegenüber wurden für MAP oder Vakuumverpackungen signifikante Effekte auf die Keimzahlen, die L*- und a*-Werte sowie die OxyMb- und MetMb-Anteile beobachtet. Während die Gesamtkeimzahl an Tag 12 in MAP 1 und 2 signifikant höher lag als in V 1 und 2, wurden für Pseudomonas spp. (Tag 8) und für Enterobacteriaceae (Tag 8, 12) in den Vakuumverpackungen höhere Keimzahlen ermittelt. Zudem wurden während der gesamten Lagerdauer höhere L*-Werte in MAP 1 und 2 beobachtet. Des Weiteren wurden in V 1 und 2 (Tag 8, 12) signifikant höhere OxyMb-Anteile und signifikant niedrigere MetMb-Anteile ermittelt. Innerhalb der Inokulationsversuche konnten keine keimreduzierenden Effekte der Nanosilberfolie auf die MRSA-Keimzahlen im Vergleich zur Kontrollfolie beobachtet werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen zum einen, dass die Empfindlichkeitslage der untersuchten Isolate gegenüber Silbernitrat als sehr gut einzustufen ist und innerhalb des untersuchten Stammkollektivs keine Toleranzentstehung gegenüber Silber zu beobachten ist. Allerdings zeigte sich auch, dass der Einsatz einer Nanosilberfolie nicht zu den erwarteten antimikrobiellen Effekten bei Verpackung von Schweinefleisch führte. Diesbezüglich sollten die Effekte der Folie anhand eines weniger proteinreichen Produktes überprüft werden, sowie die Konzentration an Nanosilber auf der Folie an das Produkt und die vermuteten Verluste durch den Tropfsaft oder durch Bindung an andere Lebensmittel- oder Folienbestandteile angepasst werden.

Studies have shown that MRSA can also be detected on pork. It is therefore possible that raw meat in particular acts as a vector for the transmission of MRSA between animals and humans. While silver has long been used in medicine, the use of nanosilver in food contact materials for germ reduction on food and for prolonging shelf life is controversially discussed. The aim of the present study was first to test the susceptibility of human and animal MRSA and MSSA isolates to silver nitrate and seven other biocides. Subsequently, the effects of a nanosilver coated film on various microbiological and physicochemical meat parameters of packaged pork should be investigated in a storage experiment. In additional experiments, the targeted effect of the nanosilver-coated foil on MRSA-inoculated pork was investigated in a further storage experiment. The susceptibility testing of MRSA and MSSA isolates of human and animal origin was performed by broth microdilution. The minimum inhibitory concentration (MIC) values were determined for alkyldiaminoethyl glycine hydrochloride, benzethonium chloride, benzalkonium chloride, chlorhexidine, acriflavine, copper sulphate, silver nitrate and zinc chloride. In addition, isolates with increased MIC results were examined for the presence of tolerance-mediating genes (lmrS, mepA, norA, sepA, qacA/B, qacG, qacH, qacJ, smr, copA, mco and czrC). The statistical analysis revealed that there were no significant differences in the MIC values between isolates of animal and human origin or between isolates of colonised and diseased hosts. The tested MSSA and MRSA isolates showed a relatively narrow, unimodal distribution pattern of MIC values for silver nitrate. Isolates with reduced susceptibilities were not observed. However, within the CC398 isolates, higher MIC results for silver nitrate were observed for human isolates than for animal isolates. In addition, CC5 isolates showed significantly higher MIC values for silver nitrate than CC22 isolates. For the additionally investigated biocides; acriflavine, alkyldiaminoethyl glycine hydrochloride, benzethonium chloride, chlorhexidine and copper sulphate, not only were unimodal patterns visible, but also significantly wider distribution patterns. A bimodal distribution of the MIC values for benzalkonium chloride and zinc chloride indicated a more tolerant subpopulation of MRSA/MSSA. For acriflavine, benzethonium chloride, benzalkonium chloride and chlorhexidine, significant differences in the MIC values of different clonal lineages were observed, whereas these differences were not detectable for alkyldiaminoethyl glycine hydrochloride, copper sulphate and zinc chloride. Isolates with elevated MIC results for quaternary ammonium compounds, acriflavine and chlorhexidine mainly harboured the genes lmrS, sepA and norA, whereas the genes qacA/B, qacG, qacJ and smr could only be sporadically detected. For isolates with increased MIC values for copper sulphate and zinc chloride, the genes mco, copA and czrC were detected. However, the statistical analysis, which included a selection of isolates with low MIC values as a comparison group, could not reveal any correlation between gene presence and reduced susceptibility of isolates. Subsequently, in packaging trials, pork cutlets was stored in four different packaging variants for a period of 12 days. The four different packaging variants were as follows: 1) modified atmosphere packaging (80% O2 + 20% CO2) with control foil (MAP 1), vacuum with control foil (V 1), modified atmosphere packaging with nanosilver foil (MAP 2) and vacuum with nanosilver foil (V 2). In a subsequent experiment, pork cutlets were inoculated with MRSA and stored in direct contact with the nanosilver and the control foil for eight days. With regard to the film type, only a few significant effects of the nanosilver foil were observed during storage. For a start, significantly higher L* values were determined for the meat on day 4 in the V 1 and MAP 1 packaging than for cutlets in the V 2 and MAP 2 packaging. Clearer results were found for the proportions of myoglobin redox forms. For the packaging variants with nanosilver, significantly higher OxyMb proportions were found on days 4 and 12 and significantly lower ones on day 8. In contrast, significantly lower levels of MetMb and DeoxyMb were found for the V 2 and MAP 2 packaging variants on days 4 and 12, while the opposite effect was observed on day 8. In contrast, significant effects on microbial counts, L* and a* values, OxyMb and MetMb content were observed for MAP or vacuum packaging. While the total viable counts on day 12 were significantly higher in MAP 1 and 2 than in V 1 and 2, higher microbial counts were observed for Pseudomonas spp. (day 8) and Enterobacteriaceae (day 8, 12) in the vacuum packages. In addition, higher L* values were observed in MAP 1 and 2 throughout the storage period. Furthermore, significantly higher OxyMb proportions and significantly lower MetMb proportions were observed in V 1 and 2 (day 8, 12). Within the inoculation experiments, no antibacterial effects of the nanosilver foil on the MRSA microbial counts compared to the control foil could be observed. The results of this study show, on the one hand, that the susceptibility of the investigated isolates to silver nitrate can be classified as very good and, on the other hand, that within the investigated strain collection, no emerging tolerance to silver can be observed. However, it was also found that using a nanosilver film did not lead to the expected antimicrobial effects in the pork packaging. In this respect, the effects of the film should be assessed using a less protein-rich product, and the concentration of nanosilver on the film should be adjusted to the product and the presumed drip losses or binding to other food or foil components.

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Kernberger-Fischer, Isa: Nanosilberbeschichtete Lebensmittelverpackungsfolie zur Reduktion von Keimen auf Schweinefleisch und Testung der Empfindlichkeit von MRSA- und MSSA-Isolaten gegenüber Silber und sieben weiteren Bioziden. Hannover . Tierärztliche Hochschule Hannover.

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