Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Emerging and Re-emerging Viruses in Animals : Evolutionary Inferences and Molecular Characterization

Jó Lei, Wendy Karen

Outbreaks of emerging and re-emerging viruses in animals inflict huge economic loses and ecologic impacts on livestock and wildlife populations, respectively. Virus surveillance and detection have been implemented as a control measure for the early identification of an infectious disease outbreak or identification of an infectious agent causing a threat to humans and/or animals. Since the introduction in the last decade of new technologies, such as next generation sequencing (NGS), the discovery rate of novel or previously undetected viruses, and detection of emerging and re-emerging viruses has dramatically increased. In addition, NGS technologies have facilitated the identification of molecular changes in virus genomes influencing virus-host interactions. In the first part of this thesis, potentially emerging and re-emerging viruses causing fatal disease in isolated animal cases were identified and their genomic and molecular characteristics determined. Frozen tissue samples were obtained from animals suspected to have died as a result of a virus infection. All samples were processed according to our in house standardized NGS protocol for virus detection. After identification of a virus candidate as potential causative agent, further genomic and molecular characterizations were performed. Pathological assessments were carried out to link the virus to a disease entity and evolutionary inferences were determined of genetic distances to known viruses. A new avian hepatitis B virus was identified that proved to be associated with hepatitis in the elegant-crested tinamou (Eudromia elegans). The new extant virus shared less than 76% sequence identity with other avian hepadnaviruses. Subsequently, novel strains of canine bocavirus and canine circovirus associated with fatal disease in dogs (Canis familiaris) in Thailand were detected. Both strains had undergone genetic recombination events, which in addition to genetic mutations, is a major driver of evolution in single stranded DNA viruses. Moreover, Batai virus (BATV), an orthobunyavirus, was identified in the brain of a harbor seal (Phoca vitulina) with encephalitis. This is the first documented case of BATV associated with central nervous system disease in a naturally infected mammal. Furthermore, dolphin morbillivirus (DMV) was detected in the brain of a stranded fin whale (Balaenoptera physalus) with encephalitis. DMV is a strain of cetacean morbillivirus (CeMV), a member of the genus Morbillivirus, which circulates in whale and dolphin species causing recurrent epizootics and is possibly associated with sporadic strandings. Taken together, these studies successfully identified and characterized known and unknown viruses in birds, terrestrial and aquatic mammals in association with different disease entities. In the second part of this thesis, evolutionary dynamics and molecular patterns of CeMV multi-host transmission among and between cetacean and phocine populations were investigated. To this end, samples of CeMV-infected tissues from animals stranded in European waters (Mediterranean and North Sea) and virus isolates were compiled and sequenced by NGS. Samples dated between 1988 and 2016. The complete consensus genome sequences coming from eight tissue samples and six virus isolates were recovered by NGS and rapid amplification of cDNA ends. The evolutionary rate of CeMV was estimated to be 2.34x10-4 nucleotide substitutions per site per year. The last ancestor of the two CeMV strains – DMV and porpoise morbillivirus – was estimated to have existed approximately 400 years ago. Genetic divergence between DMV variants belonging to different geographic locations and time points was minimal. Additional analyses of DMV from different populations of dolphins and whales showed no species-specific variations in the genomes. DMV appeared to have undergone strong purifying selection without evidence of positive selection. However, amino acid changes characteristic of each DMV clade were identified. Phylogeographic analyses of CeMV strains showed dispersal of related sequences in different oceans of the world. Furthermore, the ability of CeMV to infect different seal species, as previously documented, was also evaluated. In vitro studies indicated that DMV can use phocine CD150 cellular receptor (primary entry receptor) for efficient replication. Therefore, it was concluded that CeMV can spread through the different oceans between multiple cetacean species without previous adaptation and may pose a spillover risk to seal species. In the third part of this thesis, we characterized strains of canine distemper virus (CDV) that were associated with two historical epizootics in phocid species, Baikal seals (Pusa sibirica) and Caspian seals (Pusa caspica) in 1988 and 2000, respectively. Briefly, CDV-infected tissue samples from animals that had died during the outbreaks were sequenced by NGS. Full-length genomes were recovered. Phylogenetic analyses indicated that the strain from Baikal seals (CDVPS88) groups within the Arctic lineage, whereas the strain from Caspian seals (CDVPC00) forms a new clade (termed Caspian Sea) closest to America-1 lineage that contains vaccine strains. Moreover, Bayesian estimations suggest that the cluster Caspian Sea/America-1 diverged from all other CDVs found in the wild to date approximately in the 1840s. Caspian Sea and America-1 lineages appear to have diverged some 20 years later in 1868. In vitro experiments showed that for cell-to-cell spread, seal CDVPC00 and CDVPS88 can use canine and phocine CD150 receptors better than CDV originating from a dog host (CDVS443). However, recombinant CDVPC00EGFP showed poor infection of a canine lymphocyte cell line in comparison with recombinant CDVS443EGFP. Thus, factors other than cell-to-cell fusion, such as host immune barriers and replication factors, may play an important role in successful transmission. In conclusion, CDVPC00 had a different evolutionary history from all other CDVs found to date and belongs to probably the most ancestral wildtype lineage with hints of host adaptation. In summary, emerging/re-emerging and potentially emerging viruses causing disease in animals were identified and characterized. The viruses identified had different genomic organization and mechanisms influencing virus-host interactions. Further characterization on morbilliviruses causing recurrent epizootics in marine mammals led to findings on virus evolutionary history, global distribution patterns, and molecular determinants associated with interspecies transmission. Future investigations elucidating evolutionary and molecular mechanisms of virus-host interplay leading to host switching and successful transmission in the new host are crucial to understand virus emergence and re-emergence. This may provide tools to reduce the risk of potential epizootics among domestic animals and wildlife.

Ausbrüche von neu- und wiederauftretenden Viren bei Tieren verursachen enorme wirtschaftliche Verluste und haben ökologische Auswirkungen auf Tier- und Wildtierpopulationen. Daher werden die Detektion und Überwachung von gefährlichen human- und tierpathogenen Viren, als Kontrollmaßnahme zur Früherkennung von Ausbrüchen von Infektionskrankheiten oder zur Identifizierung infektiöser Erreger verwendet. Seit Einführung neuer Technologien wie dem „Next Generation Sequencing“ (NGS) im letzten Jahrzehnt, hat sich die Entdeckungsrate neuer und bisher nicht detektierbarer Viren sowie die Erkennung neu- und wiederauftretender Viren drastisch erhöht. Darüber hinaus haben NGS-Technologien die Identifizierung viraler Veränderungen, welche Virus-Wirt-Wechselwirkungen beeinflussen, enorm erleichtert. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden potenziell neu- und wiederauftretende Viren ermittelt, die tödliche Krankheiten in einzelnen Tieren verursachen, und deren genomische und molekulare Eigenschaften bestimmt. Hierfür wurden eingefrorene Gewebsproben von verendeten Tieren mit Verdacht auf viraler Infektion gesammelt. Alle Proben wurden anhand eines internen, standardisierten NGS-Protokolls zur Virusdetektion bearbeitet. Genomische und molekulare Charakterisierungen wurden an jenen Viruskandidaten durchgeführt, welche als potentielle Erreger in Frage kamen. Pathologische Untersuchungen wurden durchgeführt um das Virus mit dem jeweiligen Krankheitsbild in Verbindung zu setzen. Des Weiteren wurden evolutionäre Schlussfolgerungen über genetische Verwandtschaften zu schon bekannten Viren gezogen. Mit dieser Methodik wurde ein neues, aviäres Hepatitis-B-Virus identifiziert, welches mit Hepatitiden beim Perlsteißhuhn (Eudromia elegans) assoziiert werden konnte. Das neuentdeckte Virus zeigte weniger als 76% Sequenzidentität mit anderen aviären Hepadnaviren. Des Weiteren wurden neue Stämme des caninen Bocavirus und des caninen Circovirus entdeckt, welche mit tödlichen Erkrankungen bei Hunden (Canis familiaris) in Thailand in Verbindung gebracht wurden. Bei beiden Stämmen wurden genetische Rekombinationsereignisse festgestellt, welche zusätzlich zu genetischen Mutationen eine Hauptantriebskraft der Evolution von einsträngigen DNA-Viren darstellen. Darüber hinaus wurde das Bataivirus (BATV), ein Orthobunyavirus, im Gehirn eines Seehundes (Phoca vitulina) mit Enzephalitis nachgewiesen. Dies ist der erstdokumentierte Fall von BATV, welcher mit Erkrankungen des zentralen Nervensystems in einem natürlich infizierten Säugetier assoziiert wurde. Außerdem wurde ein Morbillivirus der Delfine (engl. dolphin morbillivirus, DMV) im Gehirn eines gestrandeten Finnwals (Balaenoptera physalus) mit Enzephalitis nachgewiesen. DMV gehört zu den Morbilliviren der Wale (engl. cetacean mobillivirus, CeMV), einem Mitglied der Gattung Morbillivirus, der in Wal- und Delfinarten zirkuliert, wiederkehrende Tierseuchen verursacht und womöglich Ursache sporadischer Strandungen ist. Zusammenfassend konnten im ersten Teil dieser Arbeit erfolgreich bekannte und unbekannte Viren in Vögeln, Land- und Wassersäugetieren identifiziert und charakterisiert werden, welche mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht werden konnten. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden evolutionäre Dynamiken und molekulare Muster der CeMV-Übertragung zwischen Cetacea (Wale) und Phocidae (Hundsrobben) untersucht. Zu diesem Zweck wurden Virusisolate und Gewebsproben von CeMV-infizierten Tieren aus dem Mittelmeer und der Nordsee aus den Jahren 1988 bis 2016 gesammelt und sequenziert. Die Konsensusgenomsequenzen von acht Gewebsproben und sechs Virusisolaten wurden durch NGS ermittelt und mit Hilfe von rapider Amplifikation der cDNA-Enden vervollständigt. Die evolutionäre Rate von CeMV wurde auf 2,34 × 10-4 Nucleotidsubstitutionen pro Position pro Jahr geschätzt. Es wird geschätzt, dass der letzte Vorfahre der beiden CeMV-Stämme (DMV- und das Morbillivirus der Schweinswale) vor etwa 400 Jahren existiert hat. Die genetische Divergenz zwischen DMV-Varianten von verschiedenen geografischen Orten und Zeitpunkten war minimal. Zusätzliche Analysen von DMV aus verschiedenen Delfin- und Walpopulationen zeigten keine artspezifischen Variationen in den Genomen. DMV schien eine starke reinigende Selektion ohne Anzeichen einer positiven Selektion vollzogen zu haben. Es wurden jedoch Aminosäureveränderungen identifiziert, die für die jeweiligen DMV-Kladen charakteristisch sind. Phylogeographische Analysen von CeMV-Stämmen zeigten eine Verbreitung verwandter Sequenzen in verschiedenen Ozeanen auf der Welt. Darüber hinaus wurde die Fähigkeit von CeMV verschiedene Robbenarten zu infizieren, ebenfalls bewertet. In-vitro-Studien zeigten, dass DMV den CD150-Rezeptor (primärer Eintrittsrezeptor) von Phocidae für eine effiziente Replikation verwenden kann. Daraus wurde geschlossen, dass CeMV sich ohne vorherige Anpassung durch die verschiedenen Ozeane und zwischen verschiedenen Walarten ausbreiten kann und auch das Risiko einer Übertragung auf Robbenarten bestehen könnte. Im dritten Teil dieser Dissertation wurden Stämme des caninen Staupevirus (engl. canine distemper virus, CDV) charakterisiert, die mit zwei historischen Ausbrüchen in Hundsrobben, nämlich Baikalrobben (Pusa sibirica) und Kaspischen Robben (Pusa caspica), in den Jahren 1988 und 2000 in Verbindung gebracht wurden. Hierfür wurden CDV-infizierte Gewebsproben mittels NGS sequenziert, und das komplette Genom der CDV Stämme ermittelt. Phylogenetische Analysen zeigten, dass der CDV-Stamm von Baikalrobben (CDVPS88) innerhalb der Arctic-Linie gruppiert, während der CDV-Stamm von Kaspischen Robben (CDVPC00) eine neue Klade (genannt Caspian Sea) bildet. Diese Klade ist phylogenetisch mit der America-1-Linie, die auch die Impfstämme enthält, am engsten verwandt. Darüber hinaus deuten bayessche Schätzungen darauf hin, dass das Caspian Sea – America-1-Cluster ungefähr in den 1840er Jahren von allen anderen in der Wildnis vorkommenden CDVs abgewichen ist. Caspian Sea- und America-1-Linien scheinen sich etwa 20 Jahre später im Jahr 1868 auseinander entwickelt zu haben. In-vitro-Experimente zeigten, dass CDVPC00 und CDVPS88 CD150-Rezeptoren von Kaniden und Phocidae besser für die Zell-Zell-Ausbreitung verwenden können als CDV von einem caninen Wirt (CDVS443). Jedoch zeigte rekombinantes CDVPC00EGFP eine schlechtere Infektion einer caninen Lymphozyten-Zelllinie im Vergleich zu rekombinantem CDVS443EGFP. Daher könnten auch andere Faktoren als die Zell-Zell-Fusion, zum Beispiel Immunbarrieren des Wirts und Replikationsfaktoren, eine wichtige Rolle für eine erfolgreiche Übertragung spielen. Zusammenfassend hatte CDVPC00 eine andere Evolutionsgeschichte als alle bisher gefundenen CDVs und gehört vermutlich zu den ältesten Wildtyplinien mit Hinweisen auf eine Wirtsadaptation. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit neu- und wiederauftretende tierpathogene Viren identifiziert und charakterisiert. Die identifizierten Viren wiesen eine unterschiedliche genomische Organisation und unterschiedliche Virus-Wirt-Interaktionsmechanismen auf. Die Charakterisierung von Morbilliviren, die wiederkehrende Tierseuchen bei Meeressäugern verursachten, führte zu Erkenntnissen über die Geschichte der Virusevolution, globale Verteilungsmuster und molekulare Determinanten, die mit der Interspeziesübertragung assoziiert sind. Zukünftige Untersuchungen, die evolutionäre und molekulare Mechanismen des Virus-Wirt-Zusammenspiels aufklären, welche zum Wirtwechsel und zur erfolgreichen Übertragung im neuen Wirt führen, sind entscheidend für das Verständnis von neuen und wiederkehrenden Virusausbrüchen. Dies könnte wichtige Erkenntnisse zur Verringerung des Risikos potenzieller Tierseuchenausbrüche bei domestizierten Tieren und Wildtieren liefern.

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Jó Lei, Wendy: Emerging and Re-emerging Viruses in Animals. Evolutionary Inferences and Molecular Characterization. Hannover 2018. Tierärztliche Hochschule Hannover.

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