Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Einfluss von Probenaufbereitung und Probenmatrix auf die PCR-Diagnostik von bakteriellen Zoonoseerregern am Beispiel der Modellpathogene Burkholderia cepacia und Yersinia enterocolitica

Merk, Sylvia

PCR, Bacterial DNA, DNA isolation. - Bis Ende 1999 boten in Deutschland 27 Biotechnologie-Firmen insgesamt 77 Kits für die Isolierung genomischer DNA an. Die Gewinnung der DNA beruht bei 90% der Kits auf nur fünf Prinzipien: Lyse der Zellen mit Guanidium, Entfernung von Inhibitoren mit Ionenaustauschern, Aufreinigung mit Phenol, Salzpräzipitation von Proteinen und Adsorption an Glas/Silica. Um die Eignung der Kits zur Extraktion von DNA aus Bakterien für den Nachweis mittels PCR zu überprüfen, wurden sechs Kits und vier Laborstandardmethoden verglichen. Mit definierten Keimmengen des Modellkeims Burkholderia cepacia wurden vier Probenmatrizes (Aqua bidest., Abwasser, EDTA-Blut und Lungengewebe vom Pferd) artifiziell infiziert und die Nachweisgrenzen in einer darauffolgenden PCR ermittelt. Ferner wurden Preis, Arbeitszeit und die vom Anwender bereitzustellenden Materialien ermittelt. Von allen untersuchten Verfahren lieferte Proteinase K-haltiger Lysispuffer die sensitivsten und reproduzierbarsten Ergebnisse. Diese Methode war mit am kostengünstigsten und eignete sich aufgrund der wenigen Bearbeitungsschritte gut für die Handhabung großer Probenzahlen. Deutlich schlechter schnitten die kommerziellen Kits ab, da die damit erhaltenen DNA-Präparationen in der PCR bis zu 1000-fach geringere Nachweisgrenzen ermöglichten. Sie waren zudem weit teurer und man benötigte durchweg mehr Zeit. Außerdem erhöhte sich die Gefahr der Kontamination durch zahlreiche Pipettier-, Zentrifugier-, Trocken- oder Umfüllschritte. Die Ergebnisse waren nur bedingt auf ein zweites Bakterium, Y. enterocolitica, übertragbar. Mit Proteinase K-haltigem Lysispuffer wurden im Vergleich zu DNAzolÒ aus artifiziell infiziertem Gewebe deutlich schlechtere Nachweisgrenzen erzielt als für B. cepacia. Aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit läßt sich schließen, daß für die diagnostische PCR aus klinischen Proben die Anzucht oder Konzentrierung der Erreger durch z.B. Zentrifugieren oder Sedimentieren unvermeidbar ist. Für die PCR ist es unerläßlich, eine genügende Anzahl geeigneter Negativ- und Positivkontrollen mit zu untersuchen. Trotz der scheinbaren Verbesserung der klassischen Standardmethoden ist der Nachweis nicht sensitiv genug. Die Verbesserung der Techniken zur Probenvor- und aufbereitung sollte im Vordergrund stehen, um den direkten sensitiven Nachweis bakterieller Erreger in der PCR aus jedem Probenmaterial zu ermöglichen.

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Merk, Sylvia: Einfluss von Probenaufbereitung und Probenmatrix auf die PCR-Diagnostik von bakteriellen Zoonoseerregern am Beispiel der Modellpathogene Burkholderia cepacia und Yersinia enterocolitica. Hannover 2000. Tierärztliche Hochschule.

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