Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Die Natur ramdomamplifizierter PCR-Produkte von Candida (Torulopsis) glabrata-Stämmen veterinär- und humanmedizinischen Ursprungs und ihr Einsatz zur Typisierung und Diagnostik

Badehorn, Dörte

AP-PCR, RAMP-time, species specific. - Während Candida glabrata ursprünglich als gering virulenter Keim der Transientflora von Mensch und Tier angesehen wurde, nahm im Verlauf der letzten Jahre die Häufigkeit systemischer und Schleimhautinfektionen mit schwerwiegender klinischer Symptomatik signifikant zu. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit bestand in der Optimierung der Reaktionsbedingungen für die Arbitrarily Primed PCR (AP-PCR), zur Genotypisierung klinischer Candida glabrata-Isolate human- und veterinärmedizinischen Ursprungs. In Vorversuchen wurden dazu 29 verschiedene 10-mer Primer hinsichtlich ihrer Diskriminierungspotenz untersucht, wobei sich Primer mit einem GC-Gehalt zwischen 40 und 60 % als geeignet erwiesen. Die Genotypisierung der C. glabrata-Isolate wurde mit dem Primer "AP 50-1" durchgeführt. Neben der kritischen Selektion geeigneter Primer zeigte sich die Optimierung und Standardisierung sämtlicher Reaktionsschritte als unerläßlich, da die AP-PCR empfindlich auf Veränderungen des Reaktionsprotokolls reagierte. Als entscheidender Parameter hinsichtlich Reproduzierbarkeit und Typisierbarkeit erwies sich die Variation der Aufheizzeiten zwischen Hybridisierungs- und Verlängerungstemperatur (sog. "RAMP-Zeit"): Es konnte erstmals gezeigt werden, daß eine drastische Verlängerung der RAMP-Zeit auf 1 °C/11 sec die Intensität und Anzahl der DNA-Banden von Hefepilzisolaten deutlich erhöht. Anhand der Amplifikationsmuster von 93 humanmedizinischen Isolaten konnten 3 Haupt-Genotypen definiert werden: 25,8 % der Stämme zeigten das PCR-Profil von Typ I, 70,8 % von Typ II und 2,2 % von Typ III. Diese Typen waren auch unter 17 untersuchten Isolaten veterinärmedizinischen Ursprungs zu finden, wobei jedoch die Häufigkeitsverteilung anders war: 11,8 % wurden dem Typ I zugeordnet, 17,6 % dem Typ II und 5,9 % dem Typ III. Zusätzlich wurde bei den animalen Isolaten in 64,7 % ein weiterer Typ gefunden, der sich lediglich in einer einzelnen, zusätzlichen Bande von Typ II unterschied und daher als "Typ II A" bezeichnet wurde. Die beiden Typen sind demnach genetisch eng verwandt. Das PCR-Profil von Typ I zeigte ein ähnliches Bandenmuster wie das von Typ II, während sich das Amplifikationsmuster von Typ III in zahlreichen Banden von den anderen Haupt-Genotypen unterschied. Die zuverlässige Subtypisierung der eingesetzten Isolate gelang mittels AP-PCR jedoch nicht. Dagegen war anhand des Vergleichs der AP-PCR-Profile die Unterscheidung der C. glabrata-Isolate von anderen Candida spp. möglich, da sich jede Spezies durch ein charakteristisches Bandenmuster darstellte. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine diagnostische PCR mit speziesspezifischen Primern entwickelt. Durch die Sequenzanalyse von C. glabrata-spezifischen Amplifikatbanden, die zuvor mittels AP-PCR ermittelt worden waren, gelang erstmals die Identifizierung hochspezifischer Regionen aus dem Genom von C. glabrata, was die Ableitung von 3 verschiedenen Primerpaaren ermöglichte. Mit dem Primer CG-R31-1/-2 ergab sich bei 50 getesteten Isolaten eine Spezifität von 100 %. Mit Hilfe des hier etablierten PCR-Protokolls ist es nun möglich, C. glabrata-bedingte Infektionen bei Mensch und Tier bereits nach ca. 2,5 Tagen nachzuweisen, während die Diagnosestellung mit klassischen Methoden nicht selten 4 Tage in Anspruch nimmt. Die AP-PCR eröffnet demnach nicht nur den Zugang zur Genotypisierung, sondern stellt gleichfalls ein potentes Werkzeug zur Spezies-Differenzierung dar, indem durch die Sequenzanalyse der Amplifikate die Ableitung spezifischer Primer möglich wird.

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Badehorn, Dörte: Die Natur ramdomamplifizierter PCR-Produkte von Candida (Torulopsis) glabrata-Stämmen veterinär- und humanmedizinischen Ursprungs und ihr Einsatz zur Typisierung und Diagnostik. Hannover 2000. Tierärztliche Hochschule.

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