Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Wanderungsverhalten neutrophiler Granulozyten in einem Transmigrationsverfahren

Frank, Jörg Heinrich Marstrand

Interleukin-8, PMN, transmigration, IL-8. - Diese Dissertation ist Bestandteil eines Gesamtprojektes zur Erforschung uteriner Abwehrmechanismen beim Rind. Neben einem in vivo-Endometritismodellsystem wurden in zurückliegenden Arbeiten Methoden zur Bestimmung phänotypischer (Membranimmunfluoreszenz) und funktioneller (Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), Phagozytose) Eigenschaften polymorphkerniger neutrophiler Granulozyten (PMN) etabliert. Zur vollständigeren Beurteilung der Funktionalität neutrophiler Granulozyten wurde in der vorliegenden Arbeit eine etwas andere in vitro-Migrationsmethode für PMN erarbeitet, die wesentlich mehr Informationen bietet als bisher übliche Migrationsverfahren. Der Informationsgehalt klassischer Chemotaxisassays ist auf die Anzahl und Distanz migrierter Zellen beschränkt. In der vorliegenden Arbeit wird eine Technik vorgestellt, die nicht nur eine Quantifizierung migrierter Zellen sondern auch die vergleichende immunphänotypische und funktionelle Charakterisierung migrierter wie nicht migrierter Zellen ermöglicht. Die Methode basiert auf einer 10-Well-Transmigrationskammer in der das obere Kompartiment durch eine 10 µm dicke Polycarbonatmembran mit einer Porengröße von 3 µm vom unteren getrennt ist. Die im oberen Kompartiment plazierten Zellen (0,5 - 4 x 106 Leukozyten in 200 µl Medium) werden durch einen geeigneten chemotaktischen Stimulus zur Migration in den unteren Teil der Transmigrationskammer angeregt. Zur Minimierung der Adhärenz von migrierten Leukozyten am Kammerboden wird dieser mit 115 µl unverdünntem Percoll® abgedeckt. Zur Migrationsprüfung der Zellen wird die Kammer bei 37°C und 5% CO2 in Luft meist über zwei Stunden inkubiert. Anschließend werden die Zellen der oberen und der unteren Kammer getrennt geerntet und mittels Referenzzellmethode durchflußzytometrisch quantifiziert. Neben der Quantifizierung der transmigrierten Zellen im unteren Kompartment erwies sich die Ermittlung der Summe aus transmigrierten Zellen plus denen aus dem oberen Kompartment zurückgewonnenen Zellen (Wiederfindungsrate) als sehr informativ. Zusätzlich können bei den Zellen aus beiden Kompartmenten jeweils die Vitalität, die Zusammensetzung, die Expression von Oberflächenmolekülen und verschiedene funktionelle Charakteristika wie ROS-Bildung oder Phagozytose beurteilt werden. Aufgrund seiner starken chemotaktischen Wirkung auf humane, bovine, porcine und canine PMN wurde hier rekombinantes humanes Interleukin-8 (rhIL-8) als besonders geeignetes Chemokin für die vorgestellte Methodik eingesetzt. In einem Konzentrationsbereich von 25 bis 100 ng rhIL-8/ml wanderten dosisabhängig bis zu 95% der eingesetzten PMN durch die Polycarbonatmembran und zeigten danach eine Vitalität von > 99%. Unabhängig von der Zusammensetzung der Ausgangsleukozytenpopulation lag der prozentuale Anteil der PMN an den gewanderten Zellen immer über 99,5%. Auch Hefe-aktiviertes Serum zeigte eine deutliche, aber weniger PMN-selektive chemotaktische Wirkung auf Leukozyten der genannten Spezies. N-Formyl-L-Methionyl-L-Leucyl-L-Phenylalanin (FMLP) hatte nur bei humanen PMN einen migrationsfördernden Effekt. Eine Transmigration eosinophiler Granulozyten konnte mit Hefe-aktiviertem Serum und Kulturüberstand SEA-aktivierter mononukleärer Zellen, jedoch nicht mit rhIL-8 induziert werden. Auftretende individuelle Schwankungen, modulationsbedingte Unterschiede und die hohe Interassayvarianz sowohl im Transmigrationsverhalten als auch in der Wiederfindungsrate der PMN stellen keine Schwäche sondern einen wesentlichen Vorteil des hier etablierten Transmigrationsverfahrens dar, indem sich diese Unterschiede sensitiv erfassen und quantifizieren lassen. In diesen Schwankungen spiegeln sich vermutlich differente individuelle Aktivierungszustände der frisch aus dem Spender gewonnenen Zellen oder ihre in vitro Modulation durch Kontakte mit Zellen, beeinflussenden Stoffen (hier: rhIL-8, fetales Kälberserum, Farbstoff) oder durch die Membran in der Transmigrationskammer wieder. Im Vergleich mit zeitgleich untersuchten autologen nicht migrierten PMN zeigten nach Stimulation mit 100 ng rhIL8/ml migrierte bovine neutrophile Granulozyten eine signifikante Erhöhung der Expressionsdichten von CD11b (Komplementrezeptor 3) und eines nicht näher definierten PMN-spezifischen Oberflächenmoleküls "IL-A110" (p<0,001). Die restlichen 4 untersuchten Membranstrukturen wurden durch die Transmigration in ihrer Expressionsstärke nicht moduliert: CD11c (Komplementrezeptor 4), CD11a (Leukozyten-Funktions-assoziiertes-Antigen 1), MHC-Klasse I und ein weiteres nicht näher definiertes PMN-spezifisches Oberflächenmolekül "Bo 116". Die mit rhIL-8 induzierte Transmigration führte bei bovinen PMN zu einer signifikanten Verringerung der ROS-Bildung (p<0,001). Im Gegensatz dazu unterscheiden sich nicht migrierte und migrierte PMN bezüglich ihrer Phagozytoseaktivität nicht. Die alleinige Inkubation von PMN mit 100 ng rhIL-8/ml führt jedoch zu vergleichbaren immunphänotypischen und funktionellen Einflüssen auf die Zellen, so daß die beobachteten Veränderungen vermutlich dem Einfluß des IL-8 und nicht den migrationsbedingten Mechanismen anzurechnen ist. Durch die Etablierung dieses Tranmigrationsverfahrens steht ein methodisch verbessertes Instrument zur Verfügung, mit dem sich erstmals unterschiedliche Eigenschaften von PMN unter identischen Bedingungen prüfen und beeinflussen lassen. Damit können modulierende Effekte von Leukozytensubpopulationen und einer breiten Palette von Substanzen (Arzneimittel, Hormone, bakterielle Produkte, Zytokine etc.) auf differente Charakteristika neutrophiler Granulozyten, einschließlich ihres Migrationsverhaltens qualitativ und quantitativ untersucht werden. Die hier gezeigte Verwendbarkeit bei Hund, Schwein und Mensch empfiehlt das Transmigrationsverfahren auch bei anderen Spezies als dem Rind.

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Frank, Jörg Heinrich Marstrand: Wanderungsverhalten neutrophiler Granulozyten in einem Transmigrationsverfahren. Hannover 2000. Tierärztliche Hochschule.

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