Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zur Darstellung des Expressionsmusters des Transkriptionsfaktors OCt-4 in murinen, porcinen und bovinen präimplantatorischen Embryonen

Kirchhof, Nicole

transcription factor, expression pattern, Oct-4. - Der Transkriptionsfaktor Oct-4 ist für die frühembryonalen Entwicklungsstadien der Maus von besonderer Bedeutung. Nach heutigem Kenntisstand ist Oct-4 der erste Transkriptionsfaktor, der während der frühembryonalen Entwicklung von der Maus entwicklungsabhängig reguliert wird. Während der Embryogenese der Maus ist eine Oct-4-Expression in Oozyten, frühen Furchungsstadien und Blastozysten nachgewiesen worden. Während der weiteren Differenzierung muriner Blastozysten kommt es zu einer "Downregulation" von Oct-4 in den Trophektodermzellen, so daß bei "späten" Blastozysten ab Tag 4,5 p.c. eine Oct-4-Expression nur noch in der ICM zu beobachten ist. Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war es, das Expressionsmuster von Oct-4 bei Rind und Schwein mit dem von der Maus zu vergleichen und so die Bedeutung von Oct-4 in der frühen Embryonalentwicklung von Rind und Schwein zu untersuchen. Dazu wurden mit Hilfe der Mikroinjektion unter Verwendung des Genkonstruktes GOF 18 DPE-EGFP transgene murine, bovine und porcine Embryonen erstellt. Zur Ermittlung des räumlichen Expressionsmuster des Transgens während der präimplantatorischen Embryonalentwicklung bei Maus, Schwein und Rind wurden die Embryonen mit Licht einer Wellenlänge von 450-490 nm bestrahlt. Anhand der grünen Fluoreszenz des EGFPs konnte das Expressionsmuster indirekt ermittelt werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde mit Hilfe der Immunozytochemie die Lokalisation des endogenen Oct-4-Proteins bei Blastozysten der drei genannten Spezies ermittelt. Zur Darstellung der Immunkomplexe wurden zwei verschiedene Detektionssysteme verwendet: das indirekte Immunperoxidase-Verfahren und das Immunfluoreszenz-Verfahren, wobei die Auswertung der Blastozysten mit einem konfokalen Laser Scanning-Mikroskop erfolgte. Um mögliche Unterschiede in der Oct-4-Expression zwischen in vitro produzierten und in vivo gewonnenen Blastozysten darzustellen, wurden bei Rind und Schwein in vitro produzierte mit entsprechenden in vivo gewonnenen Stadien verglichen. Folgende Ergebnisse wurden erarbeitet: Mit Hilfe des Genkonstruktes GOF 18 DPE-EGFP konnten murine, bovine und porcine transgene Embryonen erzeugt werden. Die Expression des Transgens konnte anhand der grünen Fluoreszenz des EGFPs ermittelt werden. Die durchschnittliche Furchungsrate der mikroinjizierten Mäuse- und Rinderzygoten war signifikant niedriger als in den Kontrollgruppen (Maus: 68,5 % vs. 81,7 %, P ≤ 0,05; Rind: 47,1 % vs. 60,0 %, P ≤ 0,05). Bei der Maus war zusätzlich zu der erniedrigten Furchungsrate eine herabgesetzte Entwicklungsrate zur Blastozyste zwischen injizierten und nicht injizierten Embryonen festzustellen (27,9 % vs. 62, 1 %, P ≤ 0,001). Beim Rind wurde zwischen Blastozysten der Kontrollgruppe und den injizierten Embryonen eine unterschiedliche morphologische Qualität beobachtet. Beim Schwein wurden zwischen injizierten Zygoten und den Kontrollgruppen keine unterschiedlichen Furchungs- (74,5 % vs. 76,8 %) und Blastozystenraten (33,3 % vs. 41,9 %) festgestellt. Der Anteil EGFP-positiver Embryonen (Gesamtexpressionsrate) betrug beim Rind 9,6 %, bei der Maus 16,2 % und beim Schwein 34,2 %. Der Anteil EGFP-positiver Blastozysten bezogen auf die Gesamtexpressionsrate war bei allen drei Spezies relativ gering, da viele EGFP-positive Embryonen in einem früheren Entwicklungsstadium arretierten. Die Fluoreszenz des EGFPs war fotostabil. Auch bei länger andauernder Bestrahlung konnte kein Fotobleicheffekt beobachtet werden. Es zeigten sich z.T. deutliche Intensitätsunterschiede in der Fluoreszenz sowohl zwischen den Embryonen als auch innerhalb eines Embryos, d.h. zwischen den Blastomeren eines Embryos. Bis auf einige 2-Zell-Stadien und eine murine Blastozyste, zeigten alle EGFP-positiven Embryonen eine Mosaikexpression. Dabei nahm der Anteil EGFP-positiver Blastomeren in einem Embryo mit zunehmenden Entwicklungsstand ab, so daß insbesondere in Blastozysten die Fluoreszenz auf wenige Blastomeren beschränkt war. Die Expression des Transgens war weder bei Mäuseembryonen, noch bei Schweine- oder Rinderembryonen auf die potentiell undifferenzierten Zellen (ICM) des Embryos begrenzt, sondern auch in den zum Trophektoderm differenzierten Zellen zu finden. Bei allen drei Spezies konnte sowohl mit Hilfe des farbigen Niederschlages (Immunperoxidase-Verfahren) als auch durch Fluoreszenz (Immunfluoreszenz) eine Bindung spezifischer Oct-4-Antikörper nachgewiesen werden. Im Rahmen des Immunperoxidase-Verfahrens traten z.T. falsch-positive Reaktionen (unspezifische Überfärbungen, "Hintergrundfärbungen") auf. Zudem erschwerte bei Blastozysten von Rind und Schwein der geringe farbliche Kontrast zwischen den braunen Reaktionsprodukten und den schwarzbraunen lipidhaltigen Granula die Auswertung der Blastozysten. Mit Hilfe der Immunfluoreszenz und einer Auswertung der Blastozysten mit Hilfe des Konfokalmikroskops war eine detaillierte Analyse möglich, da eine Reihe optischer Schnitte durch das Material gelegt wurde. Mit Hilfe der indirekten Immunozytochemie konnte das in der Literatur beschriebene Expressionsmuster von Oct-4 bei der Maus bestätigt werden. Im Rahmen der Differenzierung muriner Blastozysten war eine "Downregulation" von Oct-4 im Trophektoderm zu beobachten, so daß Oct-4-Protein nur noch in der ICM nachgewiesen werden konnte. Bei Schwein und Rind war dagegen keine "Downregulation" von Oct-4 im TE zu beobachten. Hier war Oct-4-Protein sowohl in der ICM als auch im TE zu finden. Die Immunkomplexe waren nicht nur im Zellkern lokalisiert, sondern z.T. auch diffus im Zytoplasma verteilt. Zwischen in vitro produzierten porcinen und bovinen Blastozysten und in vivo gewonnenen Stadien war kein Unterschied in der Expression von Oct-4 festzustellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß es mit Hilfe des Genkonstruktes GOF 18 DPE-EGFP möglich ist, transgene Embryonen bei verschiedenen Spezies zu erstellen. Anhand der EGFP-Expression konnte zwar das Expressionsmuster des Transgens ermittelt werden, doch war anhand der EGFP-Fluoreszenz nicht zwischen einer Expression integrierter DNA bzw. transienter Expression zu unterscheiden. Zudem war aufgrund der Mosaikexpression die Expression des Transgens keinem bestimmten Entwicklungsstadium bzw. Zelltyp zuzuordnen, so daß das Konstrukt zur Identifizierung undifferenzierter Zellen nicht geeignet erschien. Der direkte Vergleich von Blastozysten im Rahmen der Immunozytochemie zeigte, daß im Gegensatz zur Maus die Oct-4-Expression nicht auf die undifferenzierten Zellen beschränkt war und nicht mit einem undifferenzierten Zelltyp korrelierte. Aufgrund dieses unterschiedlichen Expressionsmusters von Oct-4 bei porcinen und bovinen Blastozysten scheint sich Oct-4 damit generell nicht zur Identifizierung undifferenzierter Zellen im Embryo und für die Generierung stabiler undifferenzierter Zellinien bei diesen Tierarten zu eignen. Die Expression von Oct-4 scheint für die ungestörte Embryonalentwicklung auch von Rind und Schwein essentiell zu sein und im Gegensatz zu anderen Genen nicht durch die In-vitro-Kulturbedingungen modifiziert zu werden. Weiterführende Untersuchungen zur Darstellung von Oct-4-Transkripten (mRNA), die Darstellung einer denkbaren Oct-4-Expression in späteren Entwicklungsstadien und die Identifizierung möglicher Zielgene von Oct-4 können zur Klärung möglicher biologischer Funktionen bei Schwein und Rind beitragen und weitere wichtige Beiträge zur physiologischen Charakterisierung präimplantatorischer bzw. postimplantatorischer Säugerembryonen liefern.

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Kirchhof, Nicole: Untersuchungen zur Darstellung des Expressionsmusters des Transkriptionsfaktors OCt-4 in murinen, porcinen und bovinen präimplantatorischen Embryonen. Hannover 2000. Tierärztliche Hochschule.

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