Proteindesign zur Veränderung der Sequenzspezifität der Restriktionsendonuklease EcoRI

Die Restriktionsendonuklease EcoRI erkennt spezifisch die DNA Sequenz GAATTC über ein sehr komplexes und redundantes Netzwerk von Wasserstoffbrückenbindungen, ionischen und van der Waals-Kontakten. Innerhalb dieses Netzwerkes bilden Gly140, Asn141 und Arg145 Kontakte zum äußeren A/T Basenpaar. Um eine Spezifitätsänderung des Enzyms in Richtung eines G/C Basenpaars herbeizuführen, was in der Erkennung der BamHI Sequenz GGATCC resultieren würde, wurden vier Mutanten erzeugt: die Doppelmutanten G140A/N141A, G140A/N141S und G140S/R145K sowie die Tripelmutante G140S/N141S/R145K. Diese Aminosäureaustausche erscheinen geeignet, ein G/C-Basenpaar gegenüber einem A/T-Basenpaar zu bevorzugen. Nach zielgerichteter Mutagenese wurden die beschriebenen Mutanten mit einem Hexahistidintag für die Affinitätschromatographie aufgereinigt. Es konnte jedoch keine saubere Aufreinigung erzielt werden, was in einer strukturellen Instabilität der Mutanten begründet liegt. Durch die Zugabe von Kalzium während des Aufreinigungsverfahren konnte zwar eine verbesserte Stabilität der Mutanten beobachtet werden, es kam jedoch zur Aggregation der aufgereinigten Enzyme. Aus diesem Grund erfolgte eine Umklonierung in das StrepTag II-System, das eine nahezu homogene Aufreinigung ermöglichte. Die Stabilisierung strukturell beeinträchtigter Mutanten durch Kalzium-Zugabe während des Aufreinigungsprozesses kann als wichtige Errungenschaft dieser Arbeit angesehen werden. Die aufgereinigten Proteine zeigten nur eine sehr geringe, unspezifische Bindung auf den bis jetzt getesteten Substraten. Sequenzspezifische DNA-Spaltung konnte nur für die Mutanten G140S/R145KStrepII und G140S/N141S/R145KStrepII detektiert werden. Die Dreifachmutante zeigt auf unmethylierter l -DNA ein Bandenmuster, welches weder dem normalen oder dem relaxierten Muster der EcoRI noch dem BamHI-Muster zugeordnet werden kann. Durch die sehr geringe Spaltaktivität verbunden mit einer Kontamination mit unspezifischer Nuklease, läßt sich keine eindeutige Aussage über die gespaltene Sequenz machen. Um eine Restspaltaktivität der Mutanten zu finden, wurden kurze Oligonukleotide mit der EcoRI-Sequenz und Modifikationen davon (am äußeren A/T Basenpaar zu Inosin, Uracil sowie zu beiden) als Substrat eingesetzt. Weiterhin wurde die BamHI-Erkennungssequenz getestet. Auch unter verschiedenen Pufferbedingungen konnte bei keinem der Oligonukleotidsubstrate eine Spaltung durch die Mutanten beobachtet werden. Daraus folgt, daß die Mutante G140S/N141S/R145K eine andere, bis jetzt noch nicht identifizierte DNA Sequenz erkennt und spaltet, was als vielversprechender Ausgangspunkt für weitere Untersuchungen in der Zukunft angesehen werden kann.