Development of a single-step transconjugation system for the introduction of multiple deletions into Actinobacillus pleuropneumoniae

Actinobacillus (A.) pleuropneumoniae ist ein Erreger von Pleuropneumonien beim Schwein und verursacht weltweit erhebliche wirtschaftliche Verluste. Die bisher kommerziell erhältlichen Subunit-Vakzinen und Totimpfstoffe induzieren keine effiziente Kreuzprotektion und erlauben keine Unterscheidung zwischen infizierten und immunisierten Tieren. Daher stellen definiert attenuierte Mutanten mit eindeutigem Phenotyp und ohne Antibiotikaresistenz wünschenswerte Kandidaten als Vakzinestämme dar. Um dieses Ziel zu erreichen, wurde ein "single-step transconjugation system", das auf homologer Rekombination und dem sacB Gen als Gegenselektionsmarker beruht, entwickelt, um so unmarkierte Deletionsmutanten von A. pleuropneumoniae zu erstellen.  Ein geeigneter konjugativer Plasmidvektor für die Insertion der unmarkierten Deletion in das Chromosom von A. pleuropneumoniae wurde konstruiert. Das Plasmid beruht auf einem "Suicide Vector", mit einem ColE1 Replikationsursprung, einer vom Plasmid RP4 stammenden Mobilisierungsfunktion (mob) und einer vom Transposon Tn903 stammenden Kanamycin-Resistenzdeterminante. Zusätzlich enthält es den in dieser Untersuchung identifizierten omlA Promotor in transkriptionaler Fusion mit dem B. subtilis sacB Gen sowie einen vier singuläre Restriktionsenzym-Schnittstellen umfassenden Polylinker, in den die mutierten Gene kloniert werden können. Durch die Verwendung dieses Plasmids wurden erstmalig unmarkierte Deletionen in das Chromosom von A. pleuropneumoniae mittels homologer Rekombination eingebracht. Dazu wurden zunächst auf der Basis ihrer Kanamycin-Resistenz und Saccharose-Empfindlichkeit Plasmidkointegrate isoliert. Dann lassen sich ohne weitere Transkonjugation unmarkierte Deletionsmutanten, die die fremde DNA verloren haben, effizient auf saccharosehaltigem Nährboden selektieren. Mittels dieser Methode wurden eine Urease-negative Mutante, eine Eisenaufnahme-defiziente Mutante und eine beide Deletionen enthaltende Doppelmutante erstellt und durch die Komplementation des ureC oder exbB Gens in trans nachgewiesen. Das in dieser Arbeit entwickelte "single-step transconjugation system" ermöglicht erstmals die Erstellung unmarkierter Deletionen im Chromosom von A. pleuropneumoniae. Weiterhin ist die Methode zur Erstellung von Mehrfachmutanten geeignet. Deshalb sollte diese Methode die Herstellung eines attenuierten A. pleuropneumoniae Lebendimpfstoffs ermöglichen, der nicht nur einen eindeutigen und leicht nachweisbaren Phänotyp besitzt, sondern auch eine Unterscheidung zwischen immunisierten und infizierten Tieren erlaubt.