Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zur Fusionsaktivität des F-Proteins des bovinen respiratorischen Synzytialvirus

Budz, Melanie-Linda

Das bovine respiratorische Synzytialvirus (BRSV) gehört innerhalb der Familie Paramyxoviridae zum Genus Pneumovirus und ist der wichtigste virale Infektionserreger akuter respiratorischer Erkrankungen bei Kälbern im Alter von sechs Wochen bis sechs Monaten. Das Fusionsprotein von BRSV ist ein Typ I Membranprotein und spielt eine entscheidende Rolle bei der pH-unabhängigen Viruspenetration in die Zielzellen, bei der Synzytienbildung und bei der Virusausbreitung. Um die nötige Konfiguration für die Entfaltung der Fusionsaktivität zu erreichen, erfolgt durch eine zelluläre Furin-ähnliche Protease die Spaltung in zwei Untereinheiten, F1 und F2, die über Disulfidbrücken miteinander verbunden bleiben. Die Angriffsstelle des Enzyms befindet sich an einer konservierten Sequenz zwischen einem Abschnitt basischer Aminosäuren (K-K-R-K-R-R) und einer hydrophoben Domäne. Die alleinige Expression des F?Proteins in transfizierten Zellen ist ausreichend für die Fusion und die Synzytienbildung. Mittels ortsgerichteter Mutagenese wurde die Wirkung von Mutationen im Furin-Spaltmotiv (R-X-K/R-R) auf die Fusionsaktivität und den Transport des F-Proteins untersucht. Zu diesem Zweck wurden die Spaltstellenmutanten RN2RN4, RS2RK4, RS2, RS4, RK1, RK4 hergestellt. Außerdem wurde eine Mutante (KS5KS6) erzeugt, bei der nicht das Furin-Spaltmotiv, sondern die benachbarten basischen Aminosäuren verändert waren. Diese Konstrukte wurden in BHK-T7- und Vero-T7-Zellen transient exprimiert. Die mutierten Proteine wurden auf qualitative Veränderungen des Transports, der Spaltung, der Fusionsaktivität und Fähigkeit zur Synzytienbildung mittels Immunfluoreszenztest und Oberflächenbiotinylierung untersucht. Die quantitative Ermittlung der Synzytienbildung erfolgte anhand der Immunfluoreszenzbilder, die zur Berechnung eines Fusionsindex herangezogen wurden. Die biologische Aktivität der exprimierten Proteine wurde zusätzlich mit einem Fusionsassay untersucht, bei dem Luziferase als Reportergen diente. Die Kotransfektion der F, G und SH-Gene zeigte, dass das Rezeptor-bindende G-Protein bei der Synzytienbildung eine wichtigere Hilfsfunktion ausübt als das SH-Protein. Bei den Mutanten mit gestörter Furin-Konsensussequenz war eine drastische bis völlige Abnahme der Synzytienbildung zu verzeichnen. Die Mutante, bei der nur die benachbarten basischen Aminosäuren ausgetauscht waren, zeigte eine nur leicht verringerte Befähigung zur Synzytienbildung. Im Hinblick auf den Oberflächentransport konnte eine deutliche Aussage nur über die gespaltene Form (F1) gemacht werden. Sie wird bei allen Mutanten an die Oberfläche transportiert, wenn auch in unterschiedlichem Umfang. Bei der Oberflä-chenbiotinylierung des ATue-Stammes traten in der SDS-PAGE zwei verschiedene Formen des F1-Proteins (50 kDa und 55 kDa) in Erscheinung. Dies scheint eine Besonderheit dieses Stammes zu sein, da zwei andere BRSV-Stämme und ein HRSV-Stamm nur die 50 kDa Form aufwiesen. Die beiden Formen waren auch bei den Mutanten zu sehen, allerdings war deren relativer Anteil sehr verschieden. Nur die 50 kDa Form scheint für die Synzytienbildung wichtig zu sein. Es waren nämlich nur jene Mutanten zur Synzytienbildung befähigt, die über eine ausgeprägte 50 kDa Form verfügten. Eine Nachspaltung des BRSV-F-Proteins durch exogene Proteasen war nicht möglich. Dies unterscheidet BRSV von einigen anderen Paramyxoviren. Der ursprüngliche Ansatz, die Spaltstelle so zu verändern, dass nur durch exogene Proteasen eine Spaltung erfolgt, war deshalb bei BRSV nicht realisierbar. Einige der Mutanten mit eingeschränkter Fusionsaktivität erscheinen dennoch interessante Ausgangskandidaten, um rekombinante Viren für Impfstoffzwecke zu erzeugen.

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Budz, Melanie-Linda: Untersuchungen zur Fusionsaktivität des F-Proteins des bovinen respiratorischen Synzytialvirus. Hannover 2000. Tierärztliche Hochschule.

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