Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zum intestinalen Metabolismus von Retinol und dessen aktivem Metaboliten all-trans-Retinsäure

Meyer, Silke

Die Epithelzellen des Intestinaltraktes benötigen für Wachstum, Differenzierung und Integrität des Epithels in hohem Maße Retinsäure (DE LUCA 1991). Dünndarmzellen sind ständig schwankenden Retinol-Konzentrationen aus der Nahrung ausgesetzt. Hinreichend untersucht ist die Veresterung des aufgenommenen Retinols in den Zellen. Ob hingegen auch eine Oxidation von Retinol zu all-trans-RA in den humanen Dünndarmenterozyten stattfindet, ist nicht bekannt und war deshalb Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Ferner war von Interesse, ob ein Phase-I-Metabolismus von all-trans-RA in den Dünndarmzellen stattfindet und welche Enzyme daran beteiligt sind. Diese Frage hat auch klinische Bedeutung, da Retinsäuren oral als Therapeutika zur Behandlung von Tumoren eingesetzt werden. Weiterhin sollte untersucht werden, ob das kürzlich entdeckte CYP26, das speziell Retinsäuren metabolisiert und durch diese induziert wird, im Darm exprimiert wird und am intestinalen Metabolismus von all-trans-RA beteiligt ist. Eine weitere Fragestellung galt der Regulation der Genexpression von CYP26 über die nukleären Retinoid-Rezeptoren. Für die in vitro-Untersuchungen wurden Cytosol und Mikrosomen aus Dünndarmenterozyten von Mensch und Schwein verwendet. Ferner kamen Caco-2 Zellen zum Einsatz, da sie in differenziertem Zustand die morphologischen und biochemischen Eigenschaften von Dünndarmenterozyten aufweisen. Bei den durchgeführten Untersuchungen wurden folgende Ergebnisse erzielt: 1.Im Enterozyten-Cytosol des Dünndarms von Mensch und Schwein konnte in vitro eine Biosynthese von all-trans-RA aus Retinol nachgewiesen werden. Diese Biosynthese war durch den ADH-Inhibitor 4-Methylpyrazol und den AlDH-Inhibitor Citral hemmbar, was auf eine Beteiligung unspezifischer cytosolischer Enzyme schließen läßt. 2.Phytol, ein Bestandteil des Chlorophyllmoleküls, konnte die Biosynthese von all-trans-RA aus Retinol in hohen Konzentrationen von 5 mM zu 68,4 % hemmen. 3.In humanen Dünndarm-Mikrosomen konnte in vitro eine Metabolisierung von all-trans-RA zu all-trans-4-hydroxy-RA und all-trans-4-oxo-RA beobachtet werden. 4.In Biopsieproben von humanem Dünndarm und Kolon konnte mit Hilfe der RT-PCR eine Expression der CYP26 mRNA nachgewiesen werden. 5.In Caco-2 Zellen gelang ebenfalls erstmalig der Nachweis einer Expression der CYP26 mRNA. Neben CYP26 waren die in den Caco-2 Zellen bzw. Caco-2-TC7 Zellen exprimierten P450-Enzyme 1A1 und 3A4 in der Lage eine 4-Hydroxylierung von all-trans-RA durchzuführen. CYP1A1 und CYP26 vermochten zusätzlich all-trans-4-oxo-RA zu bilden. 6.Eine Induktion von CYP26 in Caco-2 Zellen war über die nukleären Rezeptoren RARa , RARß und RARg möglich. Der RARa spielte hierbei die Hauptrolle. 7.Die gleichzeitige Verabreichung des synthetischen RXR-Liganden CD2608 zusammen mit den RAR-Liganden all-trans-RA oder Am580 führte zu synergistischen Effekten bei der Genexpression der CYP26 mRNA in Caco-2 Zellen. Wurde CD2608 durch den synthetischen RXR-Liganden CD3159 ersetzt, kam es im Vergleich zu einer alleinigen Gabe des RAR-Liganden ebenfalls zu einer potenzierenden Wirkung auf die Genexpression. 8.Wurde der natürliche RXR-Ligand Phytansäure zusammen mit Am580 verabreicht, konnte die Expression der CYP26 mRNA synergistisch verstärkt werden. Wurde hingegen Phytansäure mit dem natürlichen RAR-Liganden all-trans-RA kombiniert, führte dieses zu keiner Verstärkung der durch all-trans-RA allein hervorgerufenen Genexpression der CYP26 mRNA. 9.Die unter Punkt 7 und 8 beschriebenen potenzierenden Effekte bei der Genexpression von CYP26 ließen sich bei der nachfolgenden Metabolisierung von all-trans-RA nur in abgeschwächter Form wiederfinden. Darauf basierend kann festgestellt werden, daß wahrscheinlich auch in vivo bereits im humanen Dünndarm eine Biosynthese von Retinol zu all-trans-RA stattfindet und unspezifische cytosolische Enzyme daran beteiligt sind. Ob aus der Nahrung aufgenommenes Phytol in der Lage ist, die Biosynthese von all-trans-RA im Dünndarm zu hemmen, erscheint fraglich, da sehr hohe Konzentrationen an Phytol nötig waren, um eine Hemmung herbeizuführen und in Chlorophyll eingebundenes Phytol kaum vom Körper aufgenommen wird. In vitro konnte ein Phase-I-Metabolismus von all-trans-RA in humanen Dünndarm-Mikrosomen nachgewiesen werden. Da lediglich Mikrosomen von zwei verschiedenen Patienten zur Verfügung standen, und nicht bekannt war, ob und welche Medikamente die Patienten vor dem operativen Eingriff erhalten haben, sind diese Ergebnisse nur vorsichtig zu beurteilen. Trotzdem kann angenommen werden, daß auch in vivo ein solcher Metabolismus stattfindet. In welchem Ausmaß dieses der Fall ist und welche Bedeutung dem im Vergleich zum Phase-I-Metabolismus in der Leber zukommt, müßte allerdings noch in weiteren Untersuchungen geklärt werden. In Caco-2 Zellen bzw. Caco-2-TC7 Zellen waren die P450-Enzyme 1A1, 3A4 und 26 in der Lage, die Bildung von Phase-I-Metaboliten aus all-trans-RA zu katalysieren. CYP26 konnte nicht nur all-trans-RA metabolisieren, sondern wurde auch durch diese induziert. Die CYP-Enzyme 1A1 und 3A4 mußten zuvor durch andere Substanzen (ß-Naphthoflavon und Rifampicin) induziert werden. In vivo könnten auch viele andere Stoffe, z.B. für CYP1A1 das im Zigarettenrauch enthaltene Benzo(a)pyren oder für CYP3A4 das Glukokortikoid Dexamethason, die Rolle des Induktors übernehmen (LEWIS 1996). CYP26 war in Caco-2 Zellen über die nukleären Rezeptoren RARa , RARß und RARg induzierbar. Der RARa spielte hierbei die Hauptrolle. Ob diese Ergebnisse auf die Verhältnisse in vivo übertragen werden können, ist nicht sicher, da es in diesem Zusammenhang in der Literatur bereits unterschiedliche Ergebnisse bei Verwendung verschiedener Zellinien gibt (SONNEVELD et al. 1998; ABU-ABED et al. 1998). Die bei der gemeinsamen Verabreichung eines synthetischen RXR-Liganden (CD2608, CD3159) zusammen mit einem RAR-Liganden hinsichtlich einer verstärkten Expression von CYP26 erzielten Effekte stimmen gut mit der Literatur überein. In verschiedenen teratologischen Studien und Reportergenassays konnte beobachtet werden, daß die Kombination eines RXR-Agonisten mit einem RAR-Agonisten einen größeren Effekt hat, als die alleinige Gabe eines RAR-Agonisten (ELMAZAR et al. 1997; MINUCCI et al. 1997). Die gleichzeitige Verabreichung eines synthetischen RAR-Liganden zusammen mit Phytansäure führte zu ähnlichen Ergebnissen (ELMAZAR u. NAU 1998), während die Kombination eines natürlichen RAR-Liganden (all-trans-RA) mit Phytansäure zu keiner synergistischen Verstärkung der durch all-trans-RA induzierten Mißbildungen führte (ARNHOLD 1999). In den eigenen Untersuchungen konnten diese Effekte ebenfalls im Zusammenhang mit der Genexpression von CYP26 beobachtet werden.

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Meyer, Silke: Untersuchungen zum intestinalen Metabolismus von Retinol und dessen aktivem Metaboliten all-trans-Retinsäure. Hannover 2000. Tierärztliche Hochschule.

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