Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Studien zur Vitalitätsabschätzung von Cryptosporidium parvum

Eckert, Ellen

Zur Vitalitätsprüfung von Cryptosporidium parvum wurden Oozysten dem Desinfektionsmittel Neopredisan® in verschiedenen Konzentrationen (4 %, 1 %, 0,25 %, 0,0625 %, 0 %) und Inkubationszeiten (30, 60, 90, 120 min) ausgesetzt, anschließend vom Desinfektionsmittel befreit und zur Infektion von Zellkulturen und Mäusen verwendet. Die Unschädlichkeit von Desinfektionsmittelresten in Konzentrationen bis zu 0,002 % für HCT-8-Zellen wurde im MTT-Test belegt. Zur Ermittlung der C.-parvum-Vitalität wurden insgesamt 339 Zellkulturen verwendet, die mit desinfizierten oder nicht desinfizierten C.-parvum-Oozysten infiziert wurden. Die Wirtszell-DNA und Parasiten-DNA wurde gewonnen und mit einem kryptosporidienspezifischen Primer wurde eine PCR durchgeführt. Im Agarosegel wurde eine spezifische Bande bei 649 bp dargestellt. Positive PCR-Ergebnisse wurden ab einer Einsaat von 1 x 102 Oozysten/Kalotte ermittelt. Die Zunahme der Oozystenzahl/Kalotte führte zu einer Zunahme der positiven PCR-Ergebnisse. Bei Einsaat von 1 x 102 Oozysten waren 16 % der Kulturen (n=25) in der PCR positiv, während bei Verwendung von 1 x 105 Oozysten 67,4 % der Kulturen (n=43) PCR-positiv waren. Die Infektion von HCT-8-Zellkulturen mit desinfizierten Oozysten führte in Abhängigkeit von der Desinfektionsmittelkonzentration zu einer Abnahme des Anteils positiver PCR-Ergebnisse. Bei Anwendung von 4 % Neopredisan® war nur eine von 24 Kulturen positiv, während bei einer geringeren Konzentration von 0,0625 % Neopredisan® 28,6 % der Kulturen positive PCR Ergebnisse lieferten. Von 78 Kontrollkulturen, die nicht desinfizierte Oozysten erhielten, waren 61,5 % positiv. Die PCR-Banden nach Einsaat von mit Neopredisan® behandelten Oozysten waren schwächer ausgeprägt. Bei Inkubationszeiten über 30 min nahm die Zahl positiver PCR-Ergebnisse ab. Die Anwendung eines Floureszein-gekoppelten monoklonalen Antikörpers bestätigte den Vitalitätsverlust der Oozysten bei Anwendung von 4 % Neopredisan® über 120 min. Es wurden hierbei durchschnittlich nur 0,42 Foci/105 eingesäten Oozysten gezählt. Im Gegensatz dazu wurden bei Einsaat von 100 unbehandelten Oozysten 45 Foci gezählt. Die Zählung der Foci in der Zellkultur ist nur eingeschränkt quantitativ auswertbar, da ein Focus einen oder mehrere Parasitenstadien darstellen kann. Durch die Kombination der Infektion von Zellkulturen mit desinfizierten und unbehandelten C.-parvum-Oozysten und anschließende PCR konnte die Vitalität der Oozysten abgeschätzt werden. Allerdings mangelt es der Methode noch an Reproduzierbarkeit und einer (semi-) quantitativen Bewertbarkeit.

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Eckert, Ellen: Studien zur Vitalitätsabschätzung von Cryptosporidium parvum. Hannover 2001. Tierärztliche Hochschule.

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