Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

DNS-Vakzine kodierend für Staupevirus-Proteine und antigenspezifische Lymphozytenproliferation beim Hund

Schreiner, Nicole Melanie Sascha

Die Staupevirusinfektion des Hundes ist eine durch ein Morbillivirus verursachte hochkontagiöse, akut bis subakut oder chronisch verlaufende Infektionskrankheit. In den letzten Jahren wurde wiederholt von Staupeausbrüchen in geimpften Hundepopulationen berichtet, konventionelle Lebendvakzinen können Auslöser einer postvakzinalen Enzephalitis sein und die Bekämpfung der Hundestaupe bei empfänglichen Wildtierarten wird durch impfbedingte Todesfälle bzw. Staupeausbrüche erschwert. Auf der Suche nach neuen Impfstrategien entwickelten CHERPILLOD et al. (2000) eine DNS-Vakzine, die Plasmide mit dem N (Nukleokapsid)-, F (Fusion)- und H (Hämagglutinin)-Gen eines virulenten Staupevirus enthält und deren Wirksamkeit in einer ersten Testinfektion bewiesen wurde. Die geimpften Hunde entwickelten neutralisierende Antikörper und waren klinisch geschützt, eine T-Zell Antwort konnte aufgrund technischer Probleme nicht untersucht werden. In der hier vorliegenden Arbeit sollte nun ein Lymphozytenproliferationstest auf der Basis eines rekombinanten Staupeproteins, dem Nukleokapsid-Protein (NP), entwickelt werden. Die Beurteilung des neuen Tests sollte anhand der antigenspezifischen proliferativen Größenzunahme der Zellen sowie der Aufregulation bestimmter Proliferationsmarker in der Durchflusszytometrie vorgenommen werden. Für die Durchführung des Lymphozytenproliferationstestes wurden periphere mononukleäre Zellen aus dem Blut von gegen Staupe vakzinierten Hunden isoliert und unter Zugabe des rekombinanten Staupeproteins NP in Kultur gesetzt. Als Positivkontrolle diente PHA (Phytohämagglutinin), als Negativkontrolle Zellkulturmedium. An Tag 5 und 8 der Proliferation wurde die Größenzunahme der Zellen, die Aufregulation des Interleukin-2-Rezeptors sowie der Anteil CD 4 positiver T-Zellen an den proliferierenden Zellen beurteilt. Voruntersuchungen bei konventionell geimpften Hunden zeigten die Einsatzfähigkeit des Testes als gute Alternative zu den herkömmlichen radioaktiven Proliferationstests (3H-Thymidin). Durch die in der Durchflusszytometrie gegebene Möglichkeit der gleichzeitigen Beurteilung verschiedener zellulärer Parameter wird eine verbesserte Charakterisierung der T-Zellen möglich. Daher wurde der entwickelte Test während eines DNS-Vakzine Versuches angewendet. Die zweimalig im Abstand von vier Wochen mit 50, 100 oder 200µg Hundestaupe-DNS-Vakzine je Plasmid sowie konventionellen polyvalenten Impfkomponenten (Canines Adenovirus 1 + 2, Parainfluenzavirus 2 und Leptospira) und einer Parvovirus DNS-Vakzine immunisierten Hunde zeigten, ebenso wie die nur mit den konventionellen Impfkomponenten und nicht mit der Hundestaupe-DNS-Vakzine immunisierten Kontrollhunde, keine staupespezifische Stimulation der Lymphozyten. An Tag 3 und 6 nach der mit einem virulenten Staupevirus durchgeführten Belastungsinfektion, die bei allen Hunden klinisch eine systemische Staupeinfektion auslöste, wurden für die immunisierten sowie nicht-immunisierten Hunde weitere Proliferationstests angesetzt. Diese zeigten eine hochgradig herabgesetzte zelluläre Immunantwort, deutlich in der mit PHA durchgeführten Positivkontrolle zu erkennen. Die Ergebnisse spiegeln die von allen Hunden durchgemachte Staupeinfektion wieder und bestätigen die durch andere Untersucher beschriebene staupebedingte zelluläre Immunsuppression. Eine antigenspezifische Immunantwort in vitro war infolge einer in vivo entstandenen hochgradigen Depletion CD 4 positiver Zellen nicht mehr messbar. Die Hunde wurden retrospektiv nach der Euthanasie aufgrund histopathologischer Kriterien in vier Gruppen unterteilt: Tiere, die sich erholt haben und keine staupebedingten Läsionen aufwiesen und Tiere mit gering- bis hochgradigen staupebedingten Läsionen. Am deutlichsten war die Verminderung der Lymphozytenproliferation bei den Hunden, die zum Zeitpunkt der Euthanasie (20 - 36 Tage p.i.) hochgradige staupebedingte Läsionen aufwiesen. Zusätzlich wurden Leukozyten im Verlauf der Infektion durch Markierungen mit Leukozyten-Oberflächenmarkern und Virusfärbungen untersucht. Lymphozyten waren bei den hochgradig erkrankten Tieren während der gesamten Beobachtungsphase virusinfiziert. Eine Lymphopenie wurde vor allem infolge einer hochgradigen Depletion der T-Zellen, vor allem von CD 4 positiven Zellen, beobachtet. CD 8 positive Zellen und B-Zellen waren nicht so deutlich betroffen. Die Stärke der Depletion korrelierte mit der Ausprägung der histopathologischen Veränderungen. Trotz entstehender Lymphopenie konnte eine deutliche Aufregulierung von CD 44 auf diesen Zellen gemessen werden. Diese Fakten können das bei Hundestaupe vorliegende Paradoxon erklären, dass T-Zellen trotz starker Immunsuppression in das ZNS einwandern. Den vorwiegend im Gehirnparenchym nachweisbaren CD 8 positiven Zellen kann die Einwanderung in das ZNS durch die Expression von CD 44 erleichtert werden. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass bereits an Tag 3 p.i. die Ausprägung der T-Zell Depletion und die Verminderung der Lymphozytenproliferation mit der Stärke der später gefundenen histopathologischen Veränderungen korrelierten und als prognostische Faktoren bei Hundestaupe angewendet werden könnten. Weitere Studien wären notwendig, um den Mechanismus der Erholung der T-Zell-Suppression zu untersuchen. Um die antigenspezifische T-Zell Proliferation nach Staupeinfektion nachweisen zu können, müssen wahrscheinlich noch sensitivere Methoden entwickelt werden, mit denen eine Untersuchung der T-Zellen auch bei hochgradiger Lymphopenie möglich ist. Für die DNS-Vakzine ist zu sagen, dass sie nicht gemeinsam mit konventionellen Impfstoffen injiziert werden kann.

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Schreiner, Nicole Melanie Sascha: DNS-Vakzine kodierend für Staupevirus-Proteine und antigenspezifische Lymphozytenproliferation beim Hund. Hannover 2001. Tierärztliche Hochschule.

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