Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Experimentelle Untersuchungen zur In-vitro-Maturation von Kumulus-Oozyten-Komplexen von Sus scrofa f.d. in modifiziertem Whittenś Medium

Trumpa, Markus

Ziel dieser Arbeit war es den Einfluss verschiedener Hormoneinwirkungszeiten auf die Eizellreifung bei der In-vitro-Kultivierung in Whitten’s Medium zu untersuchen. Desweiteren sollte überprüft werden, welche Auswirkung verschiedene Proteinkomponenten im Maturationsmedium auf die Reifung der Eizelle haben. Nach der Kultivierung wurde die Expansion des Cumulus oophorus untersucht und durch Beurteilung des Kernstatus der Effekt der unterschiedlichen Bedingungen auf die Kernreifung festgestellt. Als Parameter des zytoplasmatischen Status der Oozyten wurden die Enzymaktivitäten der MAP-Kinase und des MPF bestimmt. Schließlich wurde durch In-vivo-Fertilisation die Befruchtungskompetenz der Oozyten bestimmter Versuchsansätze überprüft. Die Ergebnisse der Untersuchungen können wie folgt zusammengefasst werden: 1.Eine 48-stündige hormonfreie Kultivierung von KOKs führt zu signifikant schlechteren Kernreifungsergebnissen als die Kultivierung mit Hormoneinfluss, bei der sich 88,3 bis 96,7 % der Oozyten in der Metaphase II befinden. Bei hormonsupplementierter Kultivierung ist zwischen den Versuchsansätzen mit Anwesenheit der Hormone nur in der ersten Hälfte der Kultivierungsphase oder während der gesamten Zeit kein signifikant unterschiedliches Kernreifungsergebnis zu beobachten. 2.Bei der hormonsupplementierten Kultivierung in Medium mit FKS-Zusatz befinden sich nach 24 Stunden signifikant mehr Oozyten in der Metaphase I oder in späteren Meiosestadien als bei der Kultivierung in Medium mit BSA-Zusatz oder proteinfreiem aminosäuresupplementiertem Medium. Nach Kultivierung über 48 Stunden mit Hormoneinfluss in den ersten 24 Stunden oder während der Gesamtzeit zeigen sich keine signifikant unterschiedlichen Einflüsse der Protein- oder Proteinersatzkomponenten auf die Kernreifung. 3.Eine hormonfreie Kultivierung der KOKs führt zu keiner Expansion des Cumulus oophorus. Die 48-stündige Kultivierung mit Hormoneinfluss in der ersten Hälfte der Kultivierungsphase oder während der Gesamtzeit lässt keine unterschiedliche Ausprägung der Expansion beobachten. 4.Bei der 48-stündigen Kultivierung der KOKs mit Hormoneinfluss kommt es in FKS-supplementierten Medien zu einer nahezu vollständigen Expansion. Die Kultivierung in proteinfreiem Medium führt bei gleichen Bedingungen zu einer moderaten Expansion. In BSA-supplementierten Medien zeigt sich bei diesen Bedingungen nahezu keine Expansion des Kumuluszellverbandes. 5.Die Enzymaktivitäten des MPF und der MAP-Kinase sind bei Oozyten nach hormonfreier Kultivierung auf einem niedrigen Niveau. 6.Nach 48-stündiger Kultivierung der KOKs in Medium mit BSA-Zusatz ergeben sich bei kontinuierlicher Hormonsupplementierung signifikant höhere MAP-Kinase- und MPF-Aktivitäten in den Oozyten als bei Hormonanwesenheit nur während der ersten 24 Stunden. 7.Nach 48-stündiger Kultivierung in Medium mit FKS-Zusatz zeigen Oozyten bei kontinuierlicher Hormonsupplementierung höhere MPF-Aktivitäten als bei Hormonanwesenheit nur während der ersten 24 Stunden, die höheren MAP-Kinase-Aktivitäten sind bei den Oozyten nach 48-stündiger Kultivierung mit Hormonzusatz nur in den ersten 24 Stunden zu verzeichnen. 8.In proteinfreiem aminosäuresupplementiertem Medium zeigen die Oozyten nach 24- und 48-stündiger hormonsupplementierter sowie nach 24-stündiger hormonfreier Kultivierung keine signifikant unterschiedlichen MPF-Aktivitäten. Die MAP-Kinase-Aktivität der Oozyten ist nach einer Kultivierung über 48 Stunden in diesem Medium mit Hormonzusatz in den ersten 24 Stunden oder während der Gesamtzeit signifikant höher als nach Kultivierung über 24 Stunden. 9.Bei Oozyten, die als KOKs 48 Stunden lang in Whitten’s Medium mit BSA kultiviert werden, kommt es nach Maturation mit Hormonzusatz in den ersten 24 Stunden bei der In-vivo-Fertilisation zu einer Befruchtungsrate von 81,4 % und nach Maturation unter kontinuierlichem Hormoneinfluss zu einer nicht signifikant unterschiedlichen Befruchtungsrate von 77,5 %. Die in vivo gereiften Kontrolloozyten werden zu 95 % befruchtet. 10.Zwei Tage nach der In-vivo-Fertilisation ist bei den Embryonen, die aus in vitro in Whitten’s Medium mit BSA maturierten Oozyten entstanden sind, die Zellzahl geringer als bei den Kontrollembryonen, die aus in vivo gereiften Oozyten entstanden sind. 11.Ersetzt man bei der In-vitro-Maturation in Whitten’s Medium die Proteinkomponente nur durch essentielle und nichtessentielle Aminosäuren, so kommt es unabhängig davon, ob ein Hormoneinfluss während der ersten 24 Stunden oder während der gesamten Maturationszeit vorhanden ist, bei den in vitro maturierten Oozyten in vivo zu keiner Befruchtung.

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Trumpa, Markus: Experimentelle Untersuchungen zur In-vitro-Maturation von Kumulus-Oozyten-Komplexen von Sus scrofa f.d. in modifiziertem Whittenś Medium. Hannover 2001. Tierärztliche Hochschule.

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