Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Interaktion zwischen Metabolismus und Transport von Benzo[a]pyren in der Gastrointestinalen Barriere

Büsen, Roland

Die Epithelzellen des Gastrointestinaltraktes kommen mit einer Vielzahl von potentiell toxischen Stoffen in Berührung. Einer der wohl bekanntesten ist der Lebensmittelkontaminant Benzo[a]pyren aus der Gruppe der polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffe (PAKs). Es war bereits bekannt, daß neben der Leber auch die Schleimhautzellen des Dünndarms über eine Reihe von Enzymen verfügen, welche in der Lage sind, Benzo[a]pyren zu metabolisieren. Es lagen jedoch noch keine Untersuchungen darüber vor, ob entstandene Benzo[a]pyren-Metabolite wieder aus den Dünndarmzellen heraus in das Darmlumen transportiert werden können, um damit einer Resorption des Prokanzerogens entgegenzuwirken. Das mögliche Zusammenspiel von Metabolismus und luminal gerichtetem Transport bezüglich des Benzo[a]pyrens war deshalb Gegenstand dieser Arbeit. Es war von Interesse, herauszufinden, welche Metabolite von der menschlichen Darmschleimhaut gebildet werden und ob diese von speziellen membranständigen Transportproteinen ins Darmlumen zurücktransportiert werden können. Ein solcher Zusammenhang hätte für die Beurteilung der Entstehung von Krebs durch die orale Aufnahme des Prokanzerogens Benzo[a]pyren wesentliche Bedeutung, da auf diesem Wege die Bioverfügbarkeit dieses Stoffes deutlich gemindert würde. Für die in vitro-Untersuchungen wurden Caco-2 Zellen verwendet, da sie im differenzierten Zustand die morphologischen und biochemischen Eigenschaften von menschlichen Dünndarmenterozyten aufweisen. Bei den durchgeführten Untersuchungen wurden folgende Ergebnisse erzielt: 1.Anhand von Caco-2 Zellen, welche in einem 2-Kammermodell, dem Transwellâ -System, kultiviert worden waren, konnte erstmalig gezeigt werden, daß bei Inkubation der Zellen mit [14C]-Benzo[a]pyren ein apikal gerichteter Transport der radioaktiven Substanz (Benzo[a]pyren oder Benzo[a]pyren-Metabolite) in die oberen Kammern des Transwellâ -Systems existierte. Gemäß der Polarisierung der Caco-2 Zellen bestand also ein lumenseitig gerichteter Nettotransport. 2.Die Induktion der Benzo[a]pyren-metabolisierenden Enzyme CYP1A1 und CYP1B1 durch eine Inkubation der Zellen mit b -Naphthoflavon steigerte die Nettotransportraten der radioaktiv markierten Substanz (Benzo[a]pyren oder Benzo[a]pyren-Metabolite) um mehr als 300%. Weiterhin bewirkte die Inhibition dieser Enzyme durch a -Naphthoflavon eine starke Verminderung der Nettotransportraten. Damit gelang ebenfalls erstmalig der Nachweis, daß der Benzo[a]pyren-Metabolismus durch die Enzyme CYP1A1 und CYP1B1 eine wichtige Voraussetzung für einen gerichteten Transport darstellt. 3.Der apikal gerichtete Transport von der [14C]-markierten Substanz (Benzo[a]pyren oder Benzo[a]pyren-Metabolite) war energieabhängig. Die Verhinderung einer ATP-Neusynthese in den Zellen führte zu einer deutlichen Hemmung der Nettotransportraten. 4.Die chemische Inhibition der ABC-Transportproteine P-Glykoprotein, MRP1 und MRP2 zeigte bezüglich der Transportraten von der [14C]-markierten Substanz (Benzo[a]pyren oder Benzo[a]pyren-Metabolite) keinen Effekt, so daß eine Beteiligung dieser am polarisierten Nettotransport ausgeschlossen werden konnte. 5.Es gelang zum ersten Mal der Nachweis, daß Benzo[a]pyren von den Caco-2 Zellen in zwei Phasen metabolisiert wird. Als Hauptprodukte der Phase 1 des Fremdstoffmetabolismus entstanden das 1- und das 3-Hydroxybenzo[a]pyren, welche dann in der Phase 2 zu Benzo[a]pyren-1- und -3-Sulfat konjugiert worden sind. 6.Die endogen gebildeten Metabolite Benzo[a]pyren-1- und -3-Sulfat unterlagen einem stark lumenseitig gerichteten Transport, so daß deutliche Zunahmen dieser Substanzen im Medium der apikalen Transwellâ -Kammern festzustellen waren. Ihre intrazellulären Konzentrationen waren wesentlich geringer und über bestimmte Zeiträume hin konstant. Benzo[a]pyren selber war nicht in ein gerichtetes Transportgeschehen integriert. 7.Die Bildung und die Nettotransportraten von Benzo[a]pyren-1- und -3-Sulfat konnten durch die Induktion der Benzo[a]pyren-metabolisierenden Enzyme CYP1A1 und CYP1B1 mit b -Naphthoflavon in den Caco-2 Zellen deutlich gesteigert werden. Umgekehrt führte eine Inhibition dieser Enzyme zu einer drastischen Minderung der Metabolisierungs- und Nettotransportraten. 8.Die chemische Inhibition der ABC-Transportproteine P-Glykoprotein und MRP1 und MRP2 zeigte bezüglich der Transportraten von Benzo[a]pyren-1- und -3-Sulfat ebenfalls keinen Effekt, so daß abermals eine Beteiligung dieser an dem polarisierten Nettotransport ausgeschlossen werden konnte. Darauf basierend kann festgestellt werden, daß wahrscheinlich auch in vivo bereits im humanen Dünndarm ein intensiver Metabolismus des PAK Benzo[a]pyren stattfindet und daß die in Phase 2 des Fremdstoffmetabolismus gebildeten Benzo[a]pyren-Metabolite einem gerichteten Transport in das Darmlumen unterliegen. Eine Beteiligung der ABC-Transportproteine P-Glykoprotein, MRP1 und MRP2 an einem luminal gerichteten Transport der Benzo[a]pyren-Metabolite Benzo[a]pyren-1- und-3-Sulfat konnte durch den Einsatz von chemischen Inhibitoren ausgeschlossen werden. Dennoch zeigte sich eine Energieabhängigkeit der beschriebenen Transportvorgänge, so daß man davon ausgehen kann, daß beide Sulfat-Konjugate aktiv aus den Caco-2 Zellen heraustransportiert wurden. Es ist damit von Bedeutung herauszufinden, welche zellulären Strukturen in das apikal gerichtete Transportgeschehen integriert sind. Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse auf die wichtige Funktion der Enterozyten bei der Detoxifikation von mutagenen Substanzen hin und unterstreichen das Konzept einer aktiven, hocheffizienten und multifaktoriell regulierten intestinalen Barriere gegen potentiell toxische Nahrungsbestandteile.

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Büsen, Roland: Interaktion zwischen Metabolismus und Transport von Benzo[a]pyren in der Gastrointestinalen Barriere. Hannover 2001. Tierärztliche Hochschule.

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