Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Analytik von Tetracyclinen in Umwelt- und Lebensmittelproben mittels selektiver Extraktionsverfahren und sensitivem Nachweis durch HPLC gekoppelt mit mikrobiologischem Assay und Tandem-Massenspektrometrie

Sczesny, Silke

In der intensiven Nutztierhaltung werden, in die Umwelt gelangen. Durch den Einsatz dieser Substanzen kann es aber auch zu einer Bildung von Rückständen in landwirtschaftlichen Nutztieren und den Antibiotika als Therapeutika und als Leistungsförderer in erheblichem Umfang eingesetzt. Nach ihrer Ausscheidung gelangen diese Substanzen zum Teil unmetabolisiert in die Gülle. Von dort aus könnten sie, durch das Ausbringen von Gülle auf landwirtschaftlich genutzte Flächendaraus gewonnenen Lebensmittel kommen. Um zu gewährleisten, daß Wartezeiten eingehalten und keine Lebensmittel in den Verkehr gebracht werden, die Antibiotikarückstände oberhalb zulässiger Grenzwerte enthalten, werden Rückstandsuntersuchungen durchgeführt. Für diese stehen zum einen Screeningmethoden zur Verfügung. Diese basieren vor allem auf dem Prinzip des mikrobiologischen Hemmstofftestes und zeigen ausschließlich die Anwesenheit einer mikrobiologisch aktiven Substanz an. Vorteil dieser Methoden ist ihre einfache und schnelle Durchführbarkeit. Zur Absicherung eines positiven Testergebnisses werden dann chemisch – physikalische Analysemethoden verwendet. Diese Verfahren sind allerdings zeit – und arbeitsaufwendig. In der hier vorliegenden Arbeit wird durch die Verbindung beider Testprinzipien eine neue Methode zum Nachweis von Tetracyclinen, den bei landwirtschaftlichen Nutztieren am häufigsten verwendeten Antibiotika, entwickelt. Nach einer einfachen, schnellen aber selektiven Probenvorbereitung wird eine HPLC–Trennung der Analyten mit einem mikrobiologischen Assay als Detektor gekoppelt. Die HPLC dient dabei zur Aufreinigung und Anreicherung des Analyten. Durch den mikrobiologischen Assay ist eine selektive und sensitive Detektion der Tetracycline möglich. Die Entwicklung dieser Methode gliedert sich in mehrere Schritte. In einem ersten Schritt werden acht verschiedene Bakterienstämme auf ihre Antibiotikaempfindlichkeit getestet. Staphylococcus aureus RU 4220 erweist sich dabei als das empfindlichste Bakterium zum Nachweis von Tetracyclinen in Mikrotiterplatten. In einem nächsten Schritt erfolgt die Kopplung dieses Assays mit der von HAMSCHER et al. (2000) beschriebenen Methode zur HPLC–Trennung von Tetracyclinen. Zusätzlich ist es möglich, parallel zu dem mikrobiologischen Detektor, eine tandem – massenspektrometrische Detektion mit der HPLC zu koppeln. Diese neu entwickelte Methode wird zur Messung von Rückständen im Lebensmittel Ei verwendet, wie auch zur Detektion von Tetracyclinrückständen in Umweltproben (Boden und Sickerwasser). Für die genannten Matrizes werden im Rahmen dieser Arbeit neue Methoden zur Probenvorbereitung entwickelt. Diese Methoden sollen möglichst einfach durchzuführen sein aber auch eine so hohe Selektivität besitzen, daß es zu keiner Störung der mikrobiologischen oder massenspektrometrischen Detektion kommt. Die Extraktion der Bodenproben erfolgt durch das Aufschlämmen des Bodens mit Citratpuffer und einer anschließenden flüssig–flüssig Extraktion mit Essigsäureethylester. Die Sickerwasserproben werden an einer Styroldivinylbenzolphase angereichert und mit essigsaurem Methanol eluiert. Die Extraktion der Eierproben erfolgt mit einer Mischung aus Citratpuffer und Acetonitril. Eine Kombination dieser Probenvorbereitung mit universellen Detektoren, wie zum Beispiel dem UV–Detektor, ist auf Grund der mangelnden Selektivität dieser Detektoren nicht möglich. Mit dieser neu entwickelten Methode zur Analytik von Tetracyclinrückständen ist es möglich, Tetracycline, die Eierproben in Konzentrationen zwischen 200 µg/kg, dem MRL – Wert, und 150 µg/kg zugesetzt worden sind, nachzuweisen. Damit eröffnet diese Methode die Möglichkeit Tetracyclinrückstände, in lebensmittelrechtlich relevanten Konzentrationen, sicher zu bestimmen. Dies ist bei dieser Methode, durch die Verbindung von HPLC und mikrobiologischem Nachweisverfahren, im Gegensatz zu bestehenden chemisch–physikalischen Methoden, ohne großen methodischen Aufwand möglich. Bei einer Weiterentwicklung der Methode ist es vorstellbar, durch den Einsatz mehrerer Bakterienstämme und spezifischer Probenvorbereitungen und HPLC–Trennungen, ein Screeningverfahren auf Antibiotikarückstände verschiedener Antibiotikaklassen aufzubauen. Dieses könnte insbesondere zum Monitoring von Lebensmitteln auf die Anwesenheit von Antibiotikarückständen eingesetzt werden. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf der Untersuchung von Tetracyclinrückständen in Umweltproben. Bis zum jetzigen Zeitpunkt ist nichts darüber bekannt, ob Tetracycline, die landwirtschaftlichen Nutztieren verabreicht werden, tatsächlich über die Gülle in die Umwelt gelangen können. Durch die Untersuchung von Boden– und Sickerwasserproben mit der Tandem–Massenspektrometrie kann erstmals gezeigt werden, daß ein solcher Eintragsweg von Antibiotika in die Umwelt tatsächlich besteht. So ist es möglich in den oberen 40 cm von Feldern mit ortsüblicher Bewirtschaftung bis zu 253 µg Tetracyclin / kg Boden und 60 µg Chlortetracyclin / kg Boden nachzuweisen. Darüber hinaus kann es punktuell noch zu deutlich höheren Antibiotikakonzentrationen in der Umwelt kommen. So können in einer Güllekruste, die entsteht wenn Gülle nicht wie vorgeschrieben untergepflügt wird, 347 µg/kg Tetracyclin und 1433 µg/kg Chlortetracyclin nachgewiesen werden. Mit Hilfe des mikrobiologischen Assays ist es möglich zu demonstrieren, daß die Tetracycline nach der Extraktion aus den Bodenproben ihre mikrobiologische Aktivität nicht verloren haben. Damit kann dieser Assay zum Screening von Bodenproben auf Tetracyclinrückstände eingesetzt werden. Zusätzlich ist es möglich, diese neu entwickelte Methode als Screeningmethode auf weitere, eventuell unbekannte, mikrobiologisch aktive Substanzen in Umweltproben zu verwenden. Eine Identifizierung dieser Substanzen erfolgt dann mit Hilfe der Massenspektrometrie. Durch die wiederholte Untersuchung eines Feldes über ein halbes Jahr kann zudem demonstriert werden, daß Tetracycline in der Umwelt persistieren können. Anhand der in dieser Arbeit vorgestellten Daten kann erstmals gezeigt werden, daß der Triggerwert Ökotoxikologie der EMEA Leitlinie zur Zulassung neuer Tierarzneimittel unter Feldbedingungen von Altarzneimitteln überschritten werden kann. Bis zum jetzigen Zeitpunkt liegen aber nur wenige Daten vor, die es ermöglichen, einen Einfluß dieser Rückstände insbesondere auf die bakterielle Bodenflora abzuschätzen. Dabei wäre ein Einfluß der Antibiotika insbesondere auf bakterielle Antibiotikaresistenzen von besonderem Interesse. Aus diesem Grund erscheint es notwendig, daß weitere Untersuchungen zu diesem Thema durchgeführt werden. Darüber hinaus sollten die Untersuchungen auf das Auftreten weiterer Antibiotika in der Umwelt, so zum Beispiel auf Sulfonamide und Fluorchinolone, ausgeweitet werden.

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Sczesny, Silke: Analytik von Tetracyclinen in Umwelt- und Lebensmittelproben mittels selektiver Extraktionsverfahren und sensitivem Nachweis durch HPLC gekoppelt mit mikrobiologischem Assay und Tandem-Massenspektrometrie. Hannover 2001. Tierärztliche Hochschule.

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