Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Analyse der Struktur des caninen γ-Sarkoglykangens, einem Kandidatengen für erbliche Muskeldystrophie beim Hund

Conrad, Kirsten

Die Charakterisierung des caninen g-Sarkoglykangens und seine Rolle als Kandidatengen für erbliche Muskeldystrophie beim Hund war das Thema der Arbeit. Ausgangspunkt der Untersuchung war die an Muskeldystrophie erkrankte Dobermannhündin "Gini". Es wurde von einer erblichen Genese der Erkrankung ausgegangen, da bereits der Vater wegen ähnlicher Symptome euthanasiert worden war und Wurfgeschwister wegen Muskelveränderungen auffällig geworden sind. Zur Charakterisierung des caninen g-Sarkoglykangens wurden zunächst rekombinante genomische Phagenklone eingesetzt. Da die Phagenklone nicht das gesamte Gen enthielten, wurde eine genomische Hunde-BAC-Genbank mit einer murinen cDNA-Sonde durchmustert, wobei ein BAC-Kontig aus insgesamt 5 Klonen isoliert werden konnte. Der 110 kb große BAC-Klon RPCI-81_405H01 enthielt den gesamten proteinkodierenden Bereich des caninen g-Sarkoglykangens und wurde für die weitere Charakterisierung verwendet. Hybridisierungen mit g-Sarkoglykan-cDNA-Sonden ermöglichten die Identifizierung von Restriktionsfragmenten des BAC-Klons, die die Exons 2–8 des caninen g-Sarkoglykangens enthielten. Diese Restriktionsfragmente wurden in Plasmide kloniert und dienten zur Sequenzierung der Exons 2–8 sowie der flankierenden Bereiche dieser Exons. Es konnten insgesamt mehr als 15 kb DNA-Sequenz ermittelt werden, die unter den Accession-Nummern AJ306895–AJ306900 bei den Genbank/EMBL/DDBJ-Nucleotiddatenbanken hinterlegt wurden. Durch Vergleich der caninen genomischen DNA-Sequenz mit bekannten humanen g-Sarkoglykan-DNA-Sequenzen konnte die Genomstruktur des caninen g-Sarkoglykangens im Bereich der Exons 2–8 vollständig aufgeklärt werden. Die Exon/Intron-Grenzen sind dabei völlig konserviert zwischen Hund, Mensch und Maus. Der untersuchte Genabschnitt enthielt den gesamten proteinkodierenden Bereich, da im caninen g-Sarkoglykangen ähnlich wie bei Maus und Mensch das Startcodon am Anfang des Exon 2 lokalisiert ist, während das bislang noch nicht charakterisierte 1. Exon vermutlich vollständig untranslatiert bleibt. Die abgeleitete canine g-Sarkoglykan-cDNA enthält einen offenen Leserahmen von 876 bp, der für ein Protein von 291 Aminosäuren kodiert. Das g-Sarkoglykan des Hundes weist 93 % Identität zum menschlichen g-Sarkoglykan und 85 % Identität zum g-Sarkolglykan der Maus auf. Durch FISH-Analyse wurde das g-Sarkoglykangen auf Chromosom CFA 25q21-q23 lokalisiert und mittels RH-Mapping wurde es der syntänischen Gruppe 10 zugeordnet. Um die Rolle als Kandidatengen für die Muskeldystrophie zu überprüfen, wurden PCR-Produkte der Exons und flankierender Bereiche mit DNA von Gini, ihrer Mutter, ihrem Halbbruder und einem nicht verwandten Kontrollhund amplifiziert und auf Mutationen analysiert. Im kompletten kodierenden Bereich konnten keine Mutationen gefunden werden. Im flankierenden Bereich fielen einige SNP auf, die jedoch als Ursache der Erkrankung ausgeschlossen werden konnten. Es ist daher äußerst unwahrscheinlich, daß eine Mutation im caninen g-Sarkoglykangen verantwortlich für die Erkrankung von Gini ist. Eine derartige Mutation könnte allenfalls in regulatorisch wichtigen Bereichen des Gens, wie z.B. dem Promotor oder dem nicht-kodierenden 1. Exon lokalisiert sein.

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Conrad, Kirsten: Analyse der Struktur des caninen γ-Sarkoglykangens, einem Kandidatengen für erbliche Muskeldystrophie beim Hund. Hannover 2001. Tierärztliche Hochschule.

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