Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) mit geschlechtsspezifisch sortierten Spermien in aktivierte Oozyten beim Schwein

Probst, Sabine

Das Ziel der vorliegenden Untersuchungen war, eine Methode zur Verbesserung der frühembryonalen Entwicklungsraten porziner Oozyten nach intrazytoplasmatischer Spermieninjektion (ICSI) zu entwickeln und im folgenden porzine Embryonen mit vorherbestimmtem Geschlecht zu produzieren. Dazu wurde im ersten Versuchsabschnitt eine artifizielle Aktivierung porziner Oozyten entwickelt, die eine Verbesserung der frühembryonalen Entwicklungsraten nach ICSI bewirkt. Im zweiten Teil wurden porzine Embryonen mit vorherbestimmtem Geschlecht durch den Einsatz flowzytometrisch gesexter Eberspermien produziert. Die Vitalität dieser Embryonen wurde durch Embryotransfer überprüft. Für den ersten Versuchsabschnitt wurden ausschließlich in vitro gereifte (NCSU 37) Oozyten verwendet, die mit unsortierten, kryokonservierten Nebenhodenschwanzspermien befruchtet wurden. Zur Kontrolle des parthenogenetischen Entwicklungspotentials wurden in jedem Versuch kontroll- und nicht injizierte Oozyten parallel mituntersucht, die exakt den gleichen Behandlungen ausgesetzt wurden. Als Aktivierungsmethoden wurden die Wirkungen einer CaCl2-Injektion, einer kurzfristigen Inkubation in Ca2+-Ionophor und eines einzelnen elektrischen Pulses ermittelt. Die Auswertung erfolgte nach 20-stündiger In-vitro-Kultur in Fert Talp Medium anhand der Vorkernbildung. Dabei galten ungeteilte Zellstadien mit mindestens einem Vorkern und geteilte Zellstadien als aktiviert, während Oozyten mit genau zwei Vorkernen oder geteilte Stadien mit zwei Blastomeren als befruchtet angesehen wurden. Im zweiten Versuchsabschnitt wurden ebenfalls in NCSU 37 gereifte Oozyten verwendet, die mit flüssigkonservierten, entweder unsortierten oder flowzytometrisch sortierten Spermien injiziert und mit CaCl2 aktiviert wurden. Anschließend erfolgte eine In-vitro-Kultur in Fert Talp Medium für 20 Stunden, bevor die Embryonen in NCSU 23 umgesetzt wurden. Nach 48 Stunden wurde die Teilungsrate bestimmt. Geteilte Stadien wurden für weitere 120 Stunden kultiviert, wobei nach insgesamt 168-stündiger In-vitro-Kultur die Blastozystenrate ermittelt wurde. Oozyten, die nach 48 Stunden noch ungeteilt waren, wurden auf Vorkernbildung untersucht, um die vollständige Befruchtungsrate zu bestimmen. Zur Überprüfung der Vitalität mit ICSI erstellter Embryonen wurden in einem dritten Versuchsabschnitt in vitro gereifte Oozyten mit unsortierten Spermien injiziert, mit CaCl2 aktiviert und nach 48-stündiger In-vitro-Kultur als geteilte Stadien auf synchronisierte Jungsauen chirurgisch übertragen. Zusätzlich wurden in vivo gereifte Oozyten mit sortierten, Y‑chromosomalen Spermien injiziert und mit CaCl2 aktiviert. Der Transfer auf Empfängertiere erfolgte dabei direkt im Anschluss an die Spermieninjektionen. Alle Empfängertiere wurden zwischen dem 21. und 56. Tag nach ICSI mehrmals sonographisch auf Trächtigkeit untersucht. Daraus ergaben sich folgende Ergebnisse: Die Aktivierung spermieninjizierter Oozyten durch zusätzliche Injektion von CaCl2 ergab einen signifikanten Anstieg sowohl der Aktivierungs- (45,9 % vs. 70,4 %) als auch der Befruchtungsrate (33,2 % vs. 49,9 %) (p < 0,001). Die Aktivierungsrate der kontrollinjizierten Oozyten erhöhte sich ebenfalls von 11,2 % auf 26,3 % (p < 0,05), jedoch blieb die Parthenogeneserate niedrig (2,8 % vs. 8 %). Mit der Ca2+-Ionophor-Aktivierung konnte keine Verbesserung der Aktivierungsrate spermieninjizierter Oozyten erreicht werden (44,8 % vs. 42,5 %), die Befruchtungsrate reduzierte sich sogar gegenüber den nicht behandelten Oozyten (36,8 % vs. 24,5 %; p < 0,05), so dass die Ca2+-Ionophor-Behandlung für eine weitere Anwendung zur ICSI beim Schwein nicht in Betracht kommt. Der elektrische Puls erbrachte ebenfalls einen Anstieg der Aktivierungs- (43,1 % vs. 65,6 %; p < 0,001) und der Befruchtungsrate (32,3 % vs. 48,2 %; p < 0,05) spermieninjizierter Oozyten, jedoch erfolgte auch bei den kontroll- und nicht injizierten Oozyten durch die elektrische Aktivierung eine starke Zunahme der Aktivierungs- (5,6 % bzw. 0,0 % vs. 48,5 % bzw. 50,7 %; p < 0,001) und Parthenogeneseraten (0,7 % bzw. 0,0 % vs. 38,9 % bzw. 30,9 %; p < 0,001). Daher erscheint die elektrische Aktivierung zur ICSI ebenfalls nicht sinnvoll. Beim Vergleich der Injektionen sortierter und unsortierter Spermien in in vitro gereifte Oozyten ergab sich sowohl mit als auch ohne CaCl2-Aktivierung kein Unterschied bezüglich der Teilungsrate der spermieninjizierten Gruppen (48,9 % vs. 43,8 % vs. 50,9 % vs. 43,6%). Es bestanden signifikante Unterschiede zu den Kontrollgruppen (mindestens p < 0,05). Blastozysten konnten nur aus den Oozyten erhalten werden, die mit ungesexten Spermien injiziert und mit CaCl2 aktiviert (10,1 %) bzw. die mit gesexten Spermien injiziert und nicht aktiviert worden waren (3,8 %). Bezüglich der Blastozystenrate bestand zwischen allen Versuchs- und Kontrollgruppen kein signifikanter Unterschied. Insgesamt war die Entwicklungspotenz der Embryonen in vitro sehr gering. Die Entwicklungsfähigkeit der Embryonen aus mit unsortierten Spermien injizierten und mit CaCl2 aktivierten, in vitro gereiften Oozyten konnte nach Embryotransfer nicht bestätigt werden. Nur eines von vier Empfängertieren wurde tragend, jedoch endete diese Trächtigkeit nach vier Wochen. Durch Transfer von in vivo gereiften Oozyten, der direkt nach Injektion mit sortierten, y‑chromosomalen Spermien stattfand, konnte eine Trächtigkeitsrate von 100 % erzielt werden. Alle vier Empfängertiere ferkelten ab und brachten insgesamt zwölf lebende und ein totes Ferkel zur Welt. Alle Ferkel waren männlich. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass eine zusätzliche Aktivierung durch CaCl2-Injektion ein erster Schritt zu einer effektiven Verbesserung der ICSI-Technik beim Schwein ist. Des weiteren wurde die Befruchtungsfähigkeit flowzytometrisch sortierter und unsortierter Spermien mittels ICSI und die Entwicklungkompetenz dieser Embryonen zum Blastozystenstadium nachgewiesen. Die herabgesetzten Entwicklungsraten ließen auf suboptimale In-vitro-Kulturbedingungen schließen. Die Geburt von Ferkeln zeigte die Funktionsfähigkeit der ICSI-Technik beim Schwein. Die hohe Reinheit der sortierten Spermaproben wurde durch die Geburt von ausschließlich männlichen Ferkeln bestätigt.

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Probst, Sabine: Die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) mit geschlechtsspezifisch sortierten Spermien in aktivierte Oozyten beim Schwein. Hannover 2001. Tierärztliche Hochschule.

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