Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zum intrazellulären Überleben von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis in primären bovinen Makrophagen

Schümann, Beatrice

Mycobacterium avium Subspezies paratuberculosis (M. ptb) verursacht eine chronische, granulomatöse und nicht therapierbare Enteritis bei Wiederkäuern, die Paratuberkulose. Die Tiere infizieren sich in der Regel in den ersten Lebensmonaten und haben danach oft über Jahre keinerlei klinische Symptome. Mit Ausbruch der Krankheit zeigen vor allem Rinder starken intermittierenden Durchfall und fortschreitende Abmagerung bis hin zur Kachexie. Die Krankheit endet für gewöhnlich tödlich, die Pathogenese ist weitgehend unbekannt. Es gilt als gesichert, daß die Persistenz des Erregers in den Makrophagen der Darmwand eine Schlüsselrolle spielt. Ungeklärt sind jedoch die Strategie und die Mechanismen, die M. ptb das intrazelluläre Überleben in diesen Zellen ermöglichen. Von anderen pathogenen Mykobakterien, die ebenfalls in Makrophagen überleben, ist bekannt, daß sie die Effektorfunktionen der Makrophagen modulieren, um nicht abgetötet zu werden. Eine solche Modulation wird auch für M. ptb angenommen. Im Umgang mit anderen Erregern werden häufig Zellinien verwendet, da diese einfach in der Handhabung sind, nahezu beliebig viele Zellen zur Verfügung stehen, und die einzelnen Zellen annähernd identische Eigenschaften besitzen. In Ermangelung einer bovinen Makrophagenzellinie werden Arbeiten in bovinen Makrophagen mit frisch isolierten, also primären Makrophagen durchgeführt, wobei hier das Problem der hohen Diversität der Zellpopulation entsteht. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Modell der Teflonkultivierung primärer boviner Makrophagen etabliert, charakterisiert und standardisiert. Das Modell ist aufgrund der hohen Reproduzierbarkeit für Arbeiten im bovinen Modell sehr gut geeignet. In dem etablierten und standardisierten Modell wurden verschiedene Untersuchungen zur Modulation der Makrophageneffektorfunktionen durch intrazelluläre M. ptb durchgeführt. Die Ansäuerung des Phagosoms ist Teil der bakteriziden bzw. bakteriostatischen Effektorfunktionen des Makrophagen und damit ein wichtiger Schritt in der Phagosomenreifung. Andere intrazelluläre Erreger, wie z. B. M. avium, verhindern die Ansäuerung des Phagosomes, um im Makrophagen überleben zu können. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, daß vitale M. ptb, im Gegensatz zu hitzeinaktivierten, die Ansäuerung des Phagosoms nicht nur verhindern, sondern zu einer Alkalisierung der Vakuole führen. Dies ist möglicherweise ein wichtiger Pathogenitätsmechanismus vitaler M. ptb. Um intrazelluläre Erreger abtöten zu können, benötigt der Makrophage das koordinierte Zusammenspiel verschiedener Zytokine und anderer Enzyme, wie z. B. der induzierbaren NO-Synthase (iNOS). In Untersuchungen mit anderen Mykobakterien konnte die Rolle einiger Zytokine teilweise charakterisiert werden. Welche Bedeutung diese Zytokine und die iNOS in der Infektion von M. ptb in primären bovinen Makrophagen haben, wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht. Zu diesem Zweck wurde die Genexpression von Interleukin (IL) -1b , IL-6, Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-a ), IL-10, Granulozyten-Makrophagen Kolonie-Stimulationsfaktor (GM-CSF) und der iNOS in der Infektion mit vitalen sowie mit hitzeinaktivierten M. ptb gemessen. Sie lag in der Infektion mit vitalen Erregern deutlich über der mit hitzeinaktivierten Bakterien und unterschied sich im zeitlichen Verlauf. Auch diese Modifikation der Genexpression durch vitale M. ptb ist möglicherweise Teil der Pathogenitätsmechanismen, da eine Koordinierung der Zytokinexpression und damit ein Abtöten der Erreger nicht mehr möglich ist. Ein dritter Weg, den Makrophagen auszuschalten, ist das Auslösen der sogenannten Refraktärität. Sie bedeutet, daß der Makrophagen durch die erste Infektion des Erregers nicht mehr in der Lage ist, auf eine Sekundärinfektion mit den bakteriziden bzw. bakteriostatischen Effektorfunktionen zu antworten. In der vorliegenden Arbeit wurde diese Refraktärität anhand der Expression der genannten Gene untersucht. Vitale M. ptb waren in der Lage, die Zelle in einen teilweise refraktären Zustand zu versetzen: auf eine Reinfektion mit vitalen M. ptb war keine Erhöhung der TNF-a - und iNOS-Genexpression zu verzeichnen. Besonders ausgeprägt war die Refraktärität nach Stimulation mit Interferon-gamma (IFN-g ). Dieses wird im Körper von T-Zellen ausgeschüttet und dient der Aktivierung des Makrophagen, soll also das Abtöten der intrazellulären Erreger unterstützen. In der vorliegenden Arbeit führte die Stimulation infizierter Makrophagen mit IFN-g jedoch zum genauen Gegenteil: die Expression von IL-6, TNF-a , GM-CSF und der iNOS ging um 50 bis über 95 % zurück. Die zur Aktivierung des Makrophagen gedachte IFN-g -Ausschüttung könnte im Körper also zu einer weiteren Deaktvierung des Makrophagen führen. Dies ist möglicherweise ein weiterer Pathogenitätsmechanismus vitaler M. ptb.

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Schümann, Beatrice: Untersuchungen zum intrazellulären Überleben von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis in primären bovinen Makrophagen. Hannover 2001. Tierärztliche Hochschule.

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