Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Charakterisierung von Mikrogliazellen bei Hundestaupe

Stein, Veronika Maria

Die Staupevirusinfektion des Hundes ist eine durch ein Morbillivirus verursachte hochkontagiöse Infektionskrankheit. Die nervale Form geht im akuten Stadium mit einer Demyelinisierung ohne Entzündungsreaktion einher. Die Pathogenese der Demyelinisierung ist noch weitestgehend unklar. Mikrogliazellen sind wichtige Immuneffektorzellen im ZNS. Im Rahmen pathologischer Vorgänge entfalten sie ihr immunologisches Potential. Diese Zellart könnte somit bei der Pathogenese der Demyelinisierung bei Staupeläsionen im ZNS eine entscheidende Rolle spielen. Ziel der Arbeit war es daher, im Rahmen eines Challenge-Experiments die Mikroglia von Hunden mit staupetypischer Demyelinisierung im ZNS ex vivo in der Durchflusszyto­metrie immunphänotypisch und funktionell zu charakterisieren und Unterschiede im Vergleich zu nach Virusinfektion genesenen Hunden ohne besonderen Befund im ZNS bzw. zu gesunden Hunden herauszustellen. Zunächst wurde die Methode der Isolierung caniner Mikroglia etabliert. Das Gehirn wurde nach Perfusion und Entnahme in einem ersten Schritt mechanisch dissoziiert und an­schließend enzymatisch aufgeschlossen. Nach Zentrifugation der so gewonnenen Gewebe­suspension in einem PerkollÒ-Dichtevor- und -hauptgradienten sammelte sich die canine Mikroglia oberhalb der Dichten 1,077 und 1,066 g/ml spezifisch an. Mikroglia wurde über die durchflusszytometrisch ermittelte Expression von CD18 und CD11b/c identifiziert. Dieses Expressionsmuster wurde mittels immunhistochemischer Untersuchung bestätigt. Die Expression von CD45 auf caniner Mikroglia erwies sich im Unterschied zu anderen Spezies als sehr gering. Im Rahmen einer Impfstudie wurde die Mikroglia von 20 Hunden nach Challenge-Infektion mit Staupevirus immunphänotypisch und funktionell untersucht. Die Hunde wurden anhand der histopathologischen Untersuchung des ZNS in zwei Gruppen eingeteilt; Hunde mit staupetypischen ZNS-Läsionen und Demyelinisierung und genesene Hunde ohne histo­pathologische Veränderungen bzw. mit vereinzelten Mikrogliaknötchen im Bereich des ZNS, die vermutlich eine transiente Virusinfektion widerspiegeln. Als Kontrollgruppe dienten zwei gleichaltrige gesunde Hunde derselben Rasse und desselben Wurfs. Für die Gewinnung von Mikrogliazellen standen 10 bis 15g Gehirngewebe aus dem Bereich des Kleinhirnbrückenwinkels zur Verfügung. Mittels Dichtegradientenzentrifugation konnten aus diesem Material 3 - 7 x 106 Mikrogliazellen mit einer Reinheit von 62% bzw. – nach dem Setzen eines Auswertungsfensters – von 86-98% gewonnen werden. Bei Hunden mit staupetypischen Läsionen und Demyelinisierung im ZNS konnte Staupevirus mittels des monoklonalen Antikörpers D110 in ex vivo-isolierter Mikroglia nachgewiesen werden. Dieser Staupevirusnachweis korrelierte mit dem immunhistochemischen Virusnach­weis im ZNS. Zudem wies die Mikroglia bei diesen Hunden das immunphänotypische Profil einer aktivierten Zelle mit einer aufregulierten Expression von CD11b, CD1c, ICAM-1, B7-1 und B7-2, sowie MHC I und II auf. Dieses immunphänotypische Profil lässt auf folgende Effektorfunktionen der Mikroglia schließen: Antigenpräsentation, Co-Stimulation von T-Zellen und Beteiligung bei der Einwanderung und Vermittlung der Adhärenz von Lymphozyten und Monozyten. Vergleichende Untersuchungen des immunphänotypischen Profils von Monozyten aus dem peripheren Blut und der Mikroglia ergaben eine unterschiedliche Expression von CD44, CD14, CD45 und ICAM-1. Im Verlauf der Challenge-Infektion konnte bei Monozyten eine Auf- und anschließende Abregulation der Oberflächenmoleküle CD11b, CD1c, B7-2 und MHC I beobachtet werden. Dieser Immunphänotyp spiegelt die Funktionen der Monozyten, wie Antigenpräsentation, Interaktion mit Lymphozyten, Extravasation und Migration zum Entzündungsherd, im Rahmen der Immunantwort nach Staupevirusinfektion wider. Funktionell wurden bei der aktivierten Mikroglia bei Hunden mit Demyelinisierung sowohl ein größerer Anteil ROS-bildender und phagozytierender Mikrogliazellen als auch deutlich erhöhte Werte für die Intensität der ROS-Bildung und der Phagozytose festgestellt als bei Hunden ohne besondere Befunde im ZNS. Diese Ergebnisse sprechen für eine Funktion der Mikroglia als intrinsischer Makrophage des ZNS, dessen Funktion im Rahmen pathophysiologischer Zustände, wie die in dieser Studie untersuchte Staupe, verstärkt ist. Die Ergebnisse der immunphänotypischen und funktionellen Charakterisierung der Mikroglia ex vivo lassen eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der Demyelinisierung bei Hundestaupe vermuten. Mikrogliazellen sind virusinfiziert, können Antigen präsentieren – sowohl Virus über MHC I als auch vermutlich Glykolipide über CD1c, können über eine Co-Stimulation zur T-Zell-Aktivierung beitragen und über verstärkte ROS-Bildung Myelin oder die sehr empfindlichen myelinbildenden Oligodendrozyten direkt schädigen. Um die Spezifität dieser Funktionen für Hundestaupe bzw. Demyelinisierung feststellen zu können, wären weiterführende vergleichende Studien mit anderen Krankheiten nötig, auf deren Grundlage vielleicht auch alternative Therapiestrategien für bisher nicht therapierbare Erkrankungen mit Demyelinisierung entwickelt werden könnten.

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Stein, Veronika Maria: Charakterisierung von Mikrogliazellen bei Hundestaupe. Hannover 2001. Tierärztliche Hochschule.

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