Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Molekulare Untersuchungen zur Benzimidazolresistenz bei den kleinen Strongyliden der Pferde

Pape, Michaela

Benzimidazole gehören zu den wichtigsten heute eingesetzten Anthelminthika. Der Mechanismus ihrer anthelminthischen Wirkung beruht auf einer Hemmung der Polymerisation von Tubulin zu Mikrotubuli. Diese wird durch die Bindung der Benzimidazole an die b-Tubulinuntereinheit verursacht. Resistenzen gegen diese Wirkstoffgruppe sind auf strukturelle Veränderungen im Tubulin zurückzuführen. Untersuchungen zum molekularen Mechanismus der Benzimidazolresistenz bei Haemonchus contortus und Teladorsagia circumcincta haben gezeigt, dass eine Punktmutation im Codon 200 des Isotyp 1 des b-Tubulin-Gens, die zu einem Aminosäureaustausch (Phenylalanin ® Tyrosin) führt, die Ursache für die Benzimidazolresistenz ist. Aufgrund der weltweit vorkommenden Resistenzen gegen Benzimidazole bei den kleinen Strongyliden der Pferde, den bedeutendsten Endo­parasiten der Equiden, ist eine Aufklärung des Resistenzmechanismus bei diesen Nematoden von großer Bedeutung. Es wurden die cDNA-Sequenzen des b-Tubulin-Gens der aus der Subfamilie Cyathostominae stammenden Spezies Cyathostomum catinatum, Cylicocyclus nassatus, Cylicocyclus insigne, Cylicocyclus radiatus, Cylicocyclus elongatus, Cyathostomum coronatum und Cyathostomum pateratum charakterisiert. Die Identitäten der 1429 bp umfassenden Nukleinsäuresequenzen lagen zwischen 95,6 % und 100 %. Die Amplifikation des 3‘-Endes der Spezies Cy. pateratum, Cy. coronatum, Cy. catinatum und Cc. nassatus mit einem degenerierten Primer in der 3‘RACE ergab keinen Hinweis auf das Vorliegen des bei H. contortus beschriebenen Isotyp 2 b-Tubulins bei diesen Spezies. Die abgeleiteten Proteinsequenzen von 448 Aminosäuren zeigten Identitäten zwischen 98 % und 100 % und intra- und inter­spezifische Aminosäurewechsel an insgesamt zehn Positionen. Zur Aufklärung der Bedeutung des Polymorphismus im Codon 200 des b-Tubulin-Gens für die Entwicklung der Benzimidazolresistenz bei den kleinen Strongyliden wurde eine allel­spezifische PCR zur Detektion dieses SNP entwickelt. Um die Verteilung der Codon 200 Genotypen in einer benzimidazolempfindlichen und -resistenten Population zu vergleichen, wurden zunächst 100 adulte Würmer aus einer anthelminthikanaiven Population genotypisiert. Der homozygote Genotyp TTC/TTC wies eine Frequenz von 80 % auf, nur 17 % der Adulten zeigten den heterozygoten Genotyp TTC/TAC und 3 % waren homozygot TAC/TAC. Zur experimentellen Erzeugung einer benzimidazol­resistenten Population kleiner Strongyliden wurde ein natürlich infiziertes Pferd mit ansteigenden Dosierungen Fenbendazol behandelt. Die adulten Würmer wurden nach 482 Tagen bei der parasitologischen Sektion aus dem Darm des Pferdes isoliert. Die im Larvenschlupftest ermittelte ED50 lag zu Versuchsbeginn bei 0,070 µg/ml Thiabendazol und stieg im Verlauf der Behandlung auf 0,228 µg/ml Thiabendazol an, so dass die Population als phänotypisch resistent gilt. Durch die Genotypisierung der Larven III dieser Population im Verlauf der Benzimidazol­behandlung wurde eine Abnahme der homozygoten TTC/TTC Individuen sowie ein Anstieg des heterozygoten TTC/TAC und homozygoten TAC/TAC Genotypes festgestellt. Bei den untersuchten Adulten dieser Population, die bei der Sektion aus dem Darm des Pferdes isoliert wurden, kam es durch die Benzimidazolbehandlung nicht zu der erwarteten vollständigen Eliminierung der homozygoten TTC/TTC und heterozygoten TTC/TAC Individuen. Bei 42,3 % der adulten Würmer konnte der homozygot TTC/TTC Genotyp nachgewiesen werden und 55,8 % waren heterozygot TTC/TAC. Lediglich 1,9 % der Adulten wiesen den homozygoten TAC/TAC Genotyp auf. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Punktmutation im Codon 200 des b-Tubulin-Gens bei den kleinen Strongyliden nicht die einzige Ursache für die Entstehung der Benzimidazolresistenz darstellt. Unter Berücksichtigung weiterer Polymorphismen, die durch funktionelle Veränderungen einen Einfluss auf das Resistenzgeschehen haben könnten, soll ein Vergleich der b-Tubulin-Gene benzimidazolempfindlicher und -resistenter Individuen durchgeführt werden.

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Pape, Michaela: Molekulare Untersuchungen zur Benzimidazolresistenz bei den kleinen Strongyliden der Pferde. Hannover 2001. Tierärztliche Hochschule.

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