Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Nachweis gypsy-ähnlicher Sequenzen im Genom des Katzenflohs, Ctenocephalides felis felis (Bouché 1835)

Dahl, Astrid

The aim of this research project was the prove of gypsy-like sequences in the genome of the cat flea. Therefore nested PCR was practiced with two degenerated primers from the study of VAZQUEZ-MANRIQUE et al. (2000). Before trying to amplify gypsy-like sequences in the genome of C. felis, the gypsyvirus was proved in the genome of Drosophila melanogaster, in order to guarantee the functionning of this very sensitive PCR-method. PCR was done, using genomic DNA of the cat flea as template. A gypsy-positive french D. melanogaster strain was used as positive control all the time. The hybridization of the cat flea-PCR-products was carried out with a french gypsy-positive D. melanogaster probe. It was possible to prove a 410 bp  gypsy-like sequence in the genome of C. felis (genomic DNA of culture- and wildtypepopulations were pooled), which was derived from the end of the pol-gene-region and the beginning of the env-gene of D. melanogaster. This amplified sequence was characteristic of an imperfect sequence because of three deletions, of which the two biggest (26 bp and 146 bp in length) were observed in the env-gene-region. At the 410 bp gypsy-like sequence of the cat flea one forward and two reverse primers were chosen for PCR with D. melanogaster and C. felis. With this experiment the “flea-specifity” of the cat flea-sequence could be proved and contaminations could be shut out simultaneously. The PCR-product, which was received from the cat flea in this experiment, was used as a  flea-specific gypsy-like probe for hybridization and therefore served as prove of “gypsy-specifity”. In four southern blots the genomic DNA of the fruit fly and the cat flea were hybridizised on the one hand with the gypsy-positive french D. melanogaster-probe and on the other hand with the gypsy-like C. felis-probe. With this experiment the “flea-specifity” and “gypsy-specifity” of the 410 bp sequence in the genome of the cat flea could be proved.    1)     1)     So there exist gypsy-like sequences in the genome of the cat flea. 2)     2)     The amplified 410 bp sequence in the genome of the cat flea is characteristic of an imperfect sequence because of the three deletions. Because of the stop codons in this sequence, the env-gene is not able to translate functionning envelope proteins. 3)     3)     Retrotransposons are wide-spread in the genome of many organisms and the phylogenetic degree of relationship between the Diptera and Siphonaptera seems quite closely. In consideration of region-specific differences relative to the occurence of this insect Errantivirus, the presence of perfect gypsy-sequences, which could be able to encode for functional proteins, in addition to the imperfect one in the genome of C. felis seems possible. 4)     4)     C. felis is able to transmit viruses, so that this parasite could play on principle a vector role in the potential transmission of gypsyviruses provided that there are viral particles in its salivary gland. 5)     5)     This could possibly mean a progress for the researches of many diseases of the hosts of  C. felis, which are characterized by a high mutation rate.  

Ziel dieses Forschungsprojektes war der Nachweis gypsy-ähnlicher Sequenzen im Genom des Katzenflohs. Als Methode der Wahl wurde die nested PCR mit zwei degenerierten Primerpaaren aus der Arbeit von VAZQUEZ-MANRIQUE et al. (2000) genutzt. Um ein Funktionieren dieser hoch sensitiven PCR-Variante zu gewährleisten, wurde als „Vorversuch“ das Gypsyvirus im Genom von Drosophila melanogaster nachgewiesen. Bei der darauffolgenden PCR mit genomischer Katzenfloh-DNA wurde als Positivkontrolle ein sicher mit Gypsyvirus-infizierter französischer Drosophila-Stamm mitgeführt. Zur Hybridisierung der Katzenfloh-PCR-Produkte wurde eine französische gypsy-positive D. melanogaster-Sonde benutzt. Es gelang der Nachweis einer 410 bp großen gypsy-ähnlichen Sequenz im Genom von C. felis (Katzenfloh-Pool aus Wild- und Zuchtpopulationen), die aus dem Ende des pol-Gen-Bereiches und dem Anfangsteil des env-Gen-Bereiches von D. melanogaster stammte. Sie wies -verglichen mit der D. melanogaster-gypsy-Sequenz- drei Deletionen auf, wovon sich die zwei größten (26 bp und 146 bp) im env-Gen befanden. An Hand dieser 410 bp Floh-Sequenz wurden ein forward und zwei reverse Primer gewählt, die im folgenden sowohl bei D. melanogaster als auch bei C. felis eingesetzt wurden. Mit diesem Versuch konnte die „Floh-Spezifität“ der erhaltenen C. felis-Sequenz nachgewiesen und gleichzeitig Kontaminationen mit D. melanogaster-Sequenzen ausgeschlossen werden. Das PCR-Produkt des Katzenflohs aus diesem Versuch wurde im weiteren Verlauf als flohspezifische gypsy-ähnliche Sonde bei der Hybridisierung von PCR-Produkten eingesetzt und diente damit dem Nachweis der „gypsy-Spezifität“. In vier Southern Blots wurden die genomischen DNA`s von Fruchtfliege und Katzenfloh zum einen mit der gypsy-positiven D. melanogaster-Sonde, zum anderen mit der gypsy-ähnlichen C. felis-Sonde hybridisiert. Mit diesem Versuch gelang der Nachweis der „Floh-Spezifität“ und der „gypsy-Spezifität“ der nachgewiesenen 410 bp langen Sequenz aus dem Genom des Katzenflohs.    Abschließend kann man demzufolge festhalten:  1)      1)     Es existieren gypsyvirus-ähnliche Sequenzen im Genom des Katzenflohs. 2)      2)     Es handelt sich bei der 410 bp Katzenfloh-Sequenz -bedingt durch die drei Deletionen- um eine imperfekte Sequenz. Die Stopcodons, die in allen drei Leserastern der Sequenz vorhanden sind, verhindern die Translation funktionsfähiger Hüllproteine vom env-Gen. 3)      3)     Wegen der weiten Streuung von Retrotransposons im Genom der unterschiedlichsten Organismen und der phylogenetischen Verwandtschaftsbeziehung der Diptera und Siphonaptera unter gleichzeitiger Berücksichtigung regionsspezifischer Unterschiede bezüglich des Auftretens dieses Insekten-Errantivirus kann nicht ausgeschlossen werden, daß es im Genom von C. felis neben imperfekten auch perfekte gypsy-Sequenzen gibt, die für funktionale Proteine codieren. 4)      4)     C. felis ist in der Lage, Viren zu übertragen, so daß dieser Parasit prinzipiell auch als Vektor einer potentiellen Übertragung von Gypsyviren auf seine Wirte wie z.B. Mensch und Katze in Frage kommen würde, vorausgesetzt, virale Partikel befinden sich in seiner Speicheldrüse. 5)      5)     Dies könnte möglicherweise einen Fortschritt für die Ursachenforschung bestimmter Erkrankungen der Wirte von C. felis bedeuten, die mit einer erhöhten Mutationsrate einhergehen.  

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Dahl, Astrid: Nachweis gypsy-ähnlicher Sequenzen im Genom des Katzenflohs, Ctenocephalides felis felis (Bouché 1835). Hannover 2002. Tierärztliche Hochschule.

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