Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Standardisierung der quantitativen Messung reaktiver Sauerstoffspezies und der Phagozytoseaktivität caniner neutrophiler Granulozyten mittels Durchflusszytometrie

Eickhoff, Sandra

Polymorphkernige neutrophile Granulozyten (PMN) sind aufgrund ihrer Fähigkeit zur Phagozytose und Bildung Reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) ein wichtiger Bestandteil der unspezifischen Abwehr des Organismus. Der Kliniker erhofft sich von durchflusszytometrischen Messungen dieser Funktionen eine nähere Abklärung angeborener oder erworbener Immundefizienzen. Da bei gesunden Hunden starke Schwankungen in bisherigen Messungen aufgetreten waren, wird in vorliegender Studie versucht, die angewandte Methodik zu optimieren. Zur Überprüfung der Phagozytoseaktivität werden den PMN nach Isolierung aus Vollblut mittels Dichtegradientenzentrifugation Fluoreszeinisothiocyanat(FITC)-markierte, hitzeinaktivierte und serum-opsonisierte Staphylokokken zum „Fressen“ angeboten. Vergleichend dazu wird die Phagozytoseaktivität mit nicht opsonisierten Bakterien überprüft. Die durchflusszytometrische Messung erfolgt ohne und nach Stimulation der Zellen mit Phorbol-Myristat-Acetat (PMA). Durch Histopaque®-Kissen kann dem bei der Messung mittels Referenzzell-Methode unter Einsatz von CyTM5-markierten bovinen mononukleäre Zellen festgestellten hohen Zellverlust aufgrund des Festhaftens der Zellen an den Wänden der benutzen Mikrotiterplatten und Röhrchen erfolgreich entgegengewirkt werden. Jedoch wirkt sich der Gradient nachteilig auf die Phagozytoseaktivität der einzelnen Zelle aus. Zur Unterdrückung der Fluoreszenz auf der Zelloberfläche anheftender Bakterien wird versuchsweise Kristallviolett eingesetzt. Durch diesen basischen Farbstoff wird die Fluoreszenzintensität jedoch extrem gemindert. Kristallviolett ist zur Auslöschung extrazellulärer Fluoreszenz im Phagozytose-Assay mit caninen PMN wegen der starken Nebeneffekte ungeeignet. PMA wirkt in einer Konzentration von [3nmol] stimulierend auf die Phagozytoseaktivität neutrophiler Granulozyten, in höheren Konzentrationen wird die Aktivität der Zellen jedoch gehemmt. Die Fähigkeit zur Bildung von Sauerstoffradikalen in der Zelle lässt sich anhand der Umwandlung von Dihydrorhodamin-123 (DHR-123) in das fluoreszierende Rhodamin-123 (R-123) durch die gebildeten Sauerstoffspezies überprüfen. Die Messung erfolgt ebenfalls ohne und nach Stimulation mit PMA in verschiedenen Konzentrationen. Histopaque®-Kissen verhindern auch hier extreme Zellverluste, wirken sich dabei aber eher positiv auf die ROS-Bildungsfähigkeit der Zellen aus. Die Schwankungen können reduziert werden. Der Anteil an toten Zellen in den Ansätzen kann unter Einsatz des Farbstoffes To-Pro 3 im Durchflusszytometer bestimmt werden. Da die Messungen einen Anteil toter Zellen von meist unter 5 % in den Ansätzen ergaben, wurde das Sterben der Zellen als Ursache für die starken Schwankungen ausgeschlossen. Für den praktizierenden Tierarzt stellt sich die Frage, ob die Zellen eine längere Lagerzeit des Blutes auf dem Weg ins Labor unbeschadet überstehen. Unsere Untersuchungen haben gezeigt, dass auch bei einer 24-stündigen Lagerzeit bei Raumtemperatur die Granulozytenfunktion erhalten bleibt. Bei Durchführung der Assays bleibt sowohl bei Raumtemperatur als auch bei Kühlschranktemperatur die Granulozytenfunktion erhalten. Aufgrund geringgradiger Schwankungen sollte jedoch auf gleichbleibende Temperaturen während der Assay-Durchführung geachtet werden. Die Schwankungen zwischen zwei verschiedenen Untersuchern können beim ROS-Assay durch die Verwendung von Histopaque®-Kissen beseitigt werden, bei der Phagozytose können die Schwankungen auch hier nicht durch die Verminderung der Adhärenz beeinflusst werden, da sich das Histopaque®, wie bereits beschrieben, negativ auf die Zellfunktion auswirkt. Trotz Erhalt der eingesetzten Zellzahl und Optimierung der Technik sind beim ROS-Assay weiterhin Schwankungen von Tag zu Tag in den Ergebnissen festzustellen und somit weitere Einflussfaktoren nicht auszuschliessen. So ist die Messung der ROS-Bildungskapazität erkrankter Tiere immer im Vergleich zum gesunden Kontrolltier anzuraten. Bei der Überprüfung der Phagozytoseaktivität konnte mit Verminderung des Zellverlustes durch Histopaque® keine durchgreifende Verbesserung der Schwankungen erreicht werden. Das Histopaque® ist aufgrund seiner starken Nebenwirkungen auf die Phagozytose-Funktion der PMN zum Einsatz im Phagozytose-Assay nicht geeignet. Die innerhalb dieser Versuchsreihe untersuchten Hunde mit Verdacht auf mykotische Infektionen zeigten keine Minderung der Phagozytoseaktivität und ROS-Bildung.

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Eickhoff, Sandra: Standardisierung der quantitativen Messung reaktiver Sauerstoffspezies und der Phagozytoseaktivität caniner neutrophiler Granulozyten mittels Durchflusszytometrie. Hannover 2002. Tierärztliche Hochschule.

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