Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

In vitro- und In vivo-Studien zur Zellvitalität und Motoneuronenfraktion in ektopen Neuroimplantaten aus embryonalem Rattenrückenmark in Abhängigkeit von Gewinnungsmethoden und pharmakologischen Einflüssen

Haastert, Kirsten

Neuronal grafting of embryonic neurons to a transected distal stump of a peripheral nerve should be able to induce reinnervation of denervated muscles. The present study is part of a project aimed at new developments in biotechnology that provide biocompatible sieve electrodes, which can easily brought into contact with the graft and the nerve stump and which allow electrical stimulation of the grafted regenerating neurons in future. In the present study, it was investigated if embryonic (E14/15) rat spinal cord is suitable for this type of grafting. The fraction of motoneurons was of main interest, because these cells are necessary for functional reinnervation. In previous investigations, fragments of embryonic spinal cord were used for grafting. In these mechanically separated cell-suspensions, a rather low rate of only about 52 % vital cells (trypan blue negative cells) could be harvested. Using a trypsin-dissociation-technique, trypan blue staining revealed > 80 % vital cells within the whole cell-population. Cell-suspensions from dissociated embryonic ventral spinal cord were cultured on diluted Matrigel®Matrix for some hours up to 3 days. The population of large postmitotic motoneurons that express the homeoprotein Islet-1 was very small in vitro (only < 0,1 % of all cells). In addition, the number of all cells decreased over time in culture. In parallel to these in vitro experiments, short-time investigations on grafting dissociated embryonic ventral spinal cord cells were performed. For grafting, a pellet of ventral spinal cord cells was resuspended in pure Matrigel®Matrix and then injected to an autologous vein cavity fixed proximal to the distal nerve stump. One day, 3 and 7 days after transplantation, histological examination showed only a few Islet-1-reactive cells. To increase the number of motoneurons, several neurotrophic agents (BDNF, bFGF, CNTF, GDNF, IGF-1, NT-3, NT-4 and chicken muscle-extract) were tested at cultures of embryonic ventral spinal cord cells. All neurotrophic factors were ineffective to increase motoneuron-fraction and to enhance cell vitality. Therefore, two preparative methods for motoneuron-enrichment were established: the immunopanning with antibody to the p75LNTR and the metrizamide density gradient centrifugation (MDZ). Both methods allowed an enrichment of Islet-1-positive cells by a factor of >10. To mark all (large and small) motoneurons, antibody to p75LNTR was used, revealing about 30% p75-reactive cells. Thereafter in vivo experiments of MDZ-motoneuron-enriched grafts were undertaken. This investigation showed after 1 day and 3 days a trend towards and after 7 days a significant increase in the number of Islet-1-positive cells within the grafts in comparison with grafts from dissociated embryonic ventral spinal cord cells. However, the number of Islet-1-reactive cells was still low. Neurotrophic agents were also tested in cultures of motoneuron-enriched cell-suspensions derived from immunopanning or MDZ. Again, unexpected concentration-undependent results were obtained. The motoneuron-fraction could not be increased, but was even decreased in some cases. The unexpected and undesirable effects of neurotrophic supplements on motoneurons in mixed cell cultures for neuronal grafting could not be clearly explained by the present examinations. If the enrichment of motoneurons only by preparation will be able to increase the reinnervation in a satisfactory manner compared with previous studies has to be investigated in future experiments. Neurotrophic agents failed to show positive effects under the here chosen culture-conditions in vitro, but positive effects on functional reinnervation in vivo cannot be excluded by the present study. Future studies have to show if endogenous and low-concentrated supplements of neurotrophic agents (contained in Matrigel®Matrix) are sufficient to increase functional reinnervation.  

Ektope Neuroimplantate, angesiedelt auf dem distalen Stumpf eines durchtrennten, peripheren Nerven, sollen die Reinnervation denervierter Muskulatur ermöglichen. Im BMBF-Verbund-Projekt "Neuronen-Mikrosonde" bildete die Entwicklung einer biohybriden Struktur, in der ein Polyimid-Sondenimplantat zur elektrischen Kontaktierung peripherer Nerven mit embryonalen, neuronalen Zellen gekoppelt werden soll, den Hintergrund der vorliegenden Arbeit. Die Eignung des E14/15-Rattenrückenmarkes (RM) als Ausgangsgewebe für ektope Neuroimplantate wurde untersucht. Hierbei lag das Augenmerk hauptsächlich auf der Fraktion der embryonalen Motoneurone, die für eine funktionelle Reinnervation wichtig sind. Zunächst zeigte sich, dass die mechanische Dissoziation des RM-Gewebes, wie sie zuvor im Projekt üblich war, Zellen für die Implantation bereitstellte die nur zu ca. 52 % vital (Trypan blau-negativ) waren. Durch chemische Gewebe-Dissoziation mit Trypsinlösung liess sich die Vitalität auf > 80 % lebende Zellen in der Gesamtpopulation steigern. Hierüber aus Ventralhörnern des RM hergestellte Zellsuspensionen wurden auf verdünnter Matrigel®Matrix für wenige Stunden bis zu 3 Tage kultiviert. Islet-1-immunhistochemische Untersuchungen ergaben, dass der Anteil so markierter großer postmitotischer Motoneurone in vitro gering war. Die Islet-1-positiven Zellen machten nur < 0,1 % der Zellpopulation aus. Außerdem zeigte sich, dass die gesamte Zellpopulation über die Kultivierungsdauer abnahm. Parallel zu diesen ersten In vitro-Untersuchungen wurden Kurzzeitimplantationen ektoper Neuroimplantate vorgenommen. Dazu wurden Pellets aus dissoziierten Zellen embryonaler Ventralhörner in einer hier ermittelten geeigneten Implantations-Matrix (Matrigel®) resuspendiert und anschließend in einen Venensack auf dem distalen Nervenstumpf appliziert. Bei Entnahme der Implantate, nach 1 Tag, 3 und 7 Tagen, konnten nur vereinzelte Islet-1- positive Zellen nachgewiesen werden. Um die Zahl der Motoneurone zu erhöhen, wurden einige neurotrophe Substanzen (BDNF, bFGF, CNTF, GDNF, IGF-1, NT-3, NT-4 und Hühnchenmuskelextrakt) zunächst, an Zellkulturen aus embryonalen Ventralhörnern (auf verdünntem Matrigel) in vitro getestet. Alle Substanzen konnten die Fraktion der Motoneurone nicht vergrößern und auch die Vitalität der Gesamtpopulation blieb unbeeinflußt. Daher wurden als nächstes zwei präparative Methoden zur Anreicherung embryonaler Motoneurone etabliert, das sog. Immunopanning über Antikörper gegen den p75LNTR und die Metrizamid-Dichtegradienten-Zentrifugation. Mit beiden Methoden konnte eine Anreicherung der Islet-1-positiven Zellen um den Faktor > 10 erzielt werden. p75-immunhistochemische Untersuchungen, worüber sowohl große als auch kleine Motoneurone markiert werden, ergab einen Anteil von etwa 30 % p75-positiver Zellen in der Zellpopulation. Mittels Metrizamid-Dichtegradienten-Zentrifugation Motoneuron-angereicherte Implantate wurden wie oben beschrieben in vivo untersucht. Hierbei zeigte sich nach 1 und 3 Tagen eine tendenzielle und nach 7 Tagen eine signifikante Zunahme Islet-1-positiver Zellen in den Neuroimplantaten im Vergleich zur Verwendung von Zellsuspensionen aus dem ventralen dissoziierten RM. Dennoch lag ihre Zahl unter den erwarteten Werten. Auch in Motoneuron-angereicherten Kulturen wurden die oben genannten neurotrophen Substanzen getestet. Wieder zeigten sie unerwartete Wirkungen auf die Motoneuronfraktion, die durch derartige Zusätze konzentrationsunabhängig teils sogar verringert wurde. Für das Zustandekommen der unerwarteten und unerwünschten Wirkungen neurotropher Zusätze auf Motoneurone in gemischten Zellkulturen zur Verwendung in ektopen Neuroimplantaten konnte im Rahmen dieser Arbeit nur Erklärungsansätze geben werden, die tatsächliche Ursache blieb aber ungeklärt. Ob die rein präparative Anreicherung der Motoneurone den Reinnervationserfolg durch ektope Neuroimplantate zufriedenstellend gegenüber zurückliegenden Untersuchungen steigern kann, ist in weiterführenden Experimenten zu klären. Obgleich neurotrophe Faktoren unter den hier gewählten Kultivierungsbedingungnen in vitro keine positiven Wirkungen zeigten, sind den Reinnervationserfolg fördernde Effekte dieser Substanzen in vivo nicht auszuschließen. Möglicherweise reichen aber auch endogen verfügbare und zusätzlich in geringer Konzentration mit der Implantations-Matrix eingebrachte Faktoren zu diesem Zweck aus.  

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Haastert, Kirsten: In vitro- und In vivo-Studien zur Zellvitalität und Motoneuronenfraktion in ektopen Neuroimplantaten aus embryonalem Rattenrückenmark in Abhängigkeit von Gewinnungsmethoden und pharmakologischen Einflüssen. Hannover 2002. Tierärztliche Hochschule.

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