Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Identifizierung eines intramolekularen Chaperons in der intestinalen Laktase-Phlorizin Hydrolase

Peters, Karen

Lactase-phlorizin hydrolase (LPH) is an intestinal enzyme that consists of 1927 amino acids and is synthesized as a large polypeptide (prepro-LPH) of an approximate molecular weight of 215 – 230 kDa. The enzyme cleaves the disaccharid lactose and b-glycosylceramides. The generation of the mature form of LPH involves several steps. First, the signal sequence of the growing polypeptide chain is cleaved in the luminal space of the ER to generate pro-LPH. This step is followed by the removal of the proregion LPHa in the trans-Golgi-network (TGN) to generate LPHbinitial, comprising 1193 amino acids. Finally 134 amino acids are cleaved off the enzyme by exposure to luminal trypsin at the cell surface. The resulting protein is the mature enzyme LPHbfinal. Expressing the mature enzyme, LPHbfinal, in COS-1 cells does not lead to an enzymatically active protein. On the other hand the uncleaved form of the protein, pro-LPH, was observed to be enzymatically active in the same cell line. In this thesis the influence of the proregion LPHa on the protein folding, transport competence and functional activity of LPHbinitial was examined by coexpression of the individual subunits in mammalian cells. First, the relation of differently glycosylated forms of LPHbinitial in the presence and absence of the profragment was determined. It could be demonstrated that the transport rate of the protein from the ER to the Golgi has increased in the presence of LPHa reminiscent of the generation of correctly folded LPHbinitial. This effect was observed in COS-1 cells as well as in CHO cells which stably expressed LPHbinitial. The proper folding of LPHbinitial protein after interaction with the LPHa pro-domain was confirmed by the reduced sensitivity towards trypsin after interaction with the pro-domain. Furthermore an increase in the enzymatic activity could be correlated to the functional reconstitution of the protein by the presence of LPHa. The results were corroborated by confocal laser microscopy. Here, LPHa and LPHbinitial were fused to the GFP-variants, YFP and CFP, to generate the hybrid proteins LPHa-YFP, LPHbinitial–CFP and LPHbinitial-YFP. Confocal analysis showed an ER localization of the individually expressed protein LPHa-YFP and LPHbinitial-CFP. By expressing both subunits in trans, a transport competent form of LPHbinitial-CFP could be demonstrated by detection of the protein in the Golgi compartments and several transport vesicles. The analysis of LPHbinitial-YFP in MDCK cells stably expressing the protein revealed a temperature-sensitive folding mutant. This mutant was only partially able to reach the native conformation at the permissive temperature and was predominantly localized in the ER. In the presence of LPHa, however, the LPHbinitial protein was able to exit the ER and was detected in the Golgi-apparatus. The results demonstrate that the presence of the LPH profragment is a prerequisite for the acquisition of LPHbinitial to a correctly and enzymatically active form compatible with the function of LPHa as an intramolecular chaperone.  

Bei der Laktase-Phlorizin Hydrolase (LPH) handelt es sich um ein Enzym, das in den Enterozyten des Dünndarms als 1927 Aminosäuren großes Polypeptid (Pre-ProLPH) mit einem Molekulargewicht von 215 – 230 kDa synthetisiert wird und zum einen das Disaccharid Laktose und zum anderen b-Glykosylceramide hydrolytisch spaltet. Die Generierung der reifen Form der LPH umfasst verschiedene Schritte. Während des Transportes zur Bürstensaummembran entsteht zunächst durch die Abspaltung der N-terminalen Signalsequenz im ER Pro-LPH und durch die anschließende Entfernung der Proregion LPHa im trans-Golgi Netzwerk das 1193 Aminosäuren lange LPHbinitial. Von diesem werden an der Zelloberfläche durch luminal vorhandenes Trypsin weitere 134 Aminosäuren entfernt , so dass schließlich das reife Enzym LPHbfinal vorliegt. Die Expression der für das reife Enzym kodierenden Sequenz in COS-1 Zellen führt im Gegensatz zur Expression von Pro-LPH nicht zu einem enzymatisch aktiven Protein. In dieser Arbeit wurde nun der Einfluss der Proregion LPHa auf die Faltung, Transportkompetenz und funktionelle Aktivität von LPHbinitial bei Koexpression der beiden einzelnen Untereinheiten in trans in Säugetierzellen untersucht.   Zunächst wurde das Verhältnis der verschiedenen Glykosylierungsformen von LPHbinitial in An- und Abwesenheit des Profragmentes analysiert. Hier konnte gezeigt werden, dass unter dem Einfluss des in trans exprimierten LPHa die Transportrate des Proteins vom ER zum Golgi-Apparat und somit die Faltung zur korrekten Konformation anstieg. Dieser Effekt konnte sowohl in COS-1 Zellen als auch in CHO-Zellen, die LPHbinitial stabil exprimierten, beobachtet werden. Die verbesserte Faltung des LPHbinitial-Proteins nach der Interaktion mit der LPHa Prodomäne konnte durch die verminderte Trypsinsensitivität des Proteins bestätigt werden. Außerdem führte die Anwesenheit von LPHa durch die Konformationsänderung zur funktionellen Rekonstitution des Proteins, da ein Anstieg der enzymatischen Aktivität gezeigt werden konnte. Diese Ergebnisse sollten durch konfokale Lasermikroskopie bestätigt werden. Hierzu wurden LPHa und LPHbinitial mit verschiedenen GFP-Varianten, YFP und CFP, zu den Hybridproteinen LPHa-YFP, LPHbinitial-CFP und LPHbinitial-YFP fusioniert. Die konfokale Analyse zeigte eine ER-Lokalisation der einzeln exprimierten Untereinheiten LPHa-YFP und LPHbinitial-CFP. Durch die Expression der beiden Untereinheiten in trans konnte LPHbinitial-CFP jedoch seine Transportkompetenz erlangen und sowohl im Golgi-Apparat als auch in Transportvesikeln angetroffen werden. Die Analyse von LPHbinitial-YFP in einer das Protein stabil exprimierenden Zelllinie zeigte, dass es sich hierbei um eine temperatursensitive Faltungsmutante handelt, die bei permissiver Temperatur zumindest zu einem Teil ihre native Konformation erlangen kann. Auch in dieser Zelllinie erbrachte die konfokale Fluoreszenzmikroskopie die Lokalisation der LPHbinitial-Untereinheit im ER, während unter dem Einfluss von LPHa diese Transportblockade überwunden wurde, so dass das Protein auch im Golgi-Apparat nachgewiesen werden konnte. Diese Ergebnisse zeigten, dass das Profragment der LPH für die Faltung des Proteins in seine native und enzymatisch aktive Form notwendig ist, und somit die Funktion eines intramolekularen Chaperons erfüllt.  

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Peters, Karen: Identifizierung eines intramolekularen Chaperons in der intestinalen Laktase-Phlorizin Hydrolase. Hannover 2002. Tierärztliche Hochschule.

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