Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

CE11- ein neuartiger 12-Transmembrandomänen-Cotransporter des Hundenebenhodens

Wingbermühle, Anke

The canine epididymal gene product CE11 encodes a 12-transmembrane-domain-cotransporter which is located on the apical membrane of the epididymal duct epithelium. Transport proteins identified in this location are usually involved in the regulation of the epididymal fluid composition which is essential for the maturation and storage of spermatozoa. Therefore, it is likely that CE11 also plays an important role in the functionality of the canine epididymis. Aims of the present thesis were the reexamination and completion of the CE11 cDNA sequence, the examination of the newly obtained clones concerning the occurrance of an open reading frame as well as the detection of the CE11 mRNA and the putative protein in epdidymal tissue and epithelial cell cultures. The open reading frame of the previously only partially known sequence could be completed by 5’Inverted PCR. Screening of the public databases identified two complete cDNA-clones of murine and human thymus tissue that showed a significant sequence homology to CE11. Their putative protein products have been called TSCOT (thymic stromal cotransporter). There were two more incomplete cDNA clones present from pooled pig and cow tissue, including thymus, that are highly similar to CE11. According to various secondary structure prediction programs CE11 and TSCOT encode an integral membrane protein with 12 membrane spanning regions. Their structure resembles members of a Na+/Ca2+-transporter family of the ABC(ATP-Binding Casette)-protein class. However, based on the nucleotide sequence alignment a bacterial gene product showed the  highest similarity (~25%) to CE11. It encodes a tetracycline transporter that also belongs to the class of ABC-proteins. However, an ATP-binding motif could not be identified in either the CE11 or the TSCOT sequence which suggests that both are actually members of a novel class of 12-transmembrane domain cotransporters. The tissue distribution of the CE11  Transcript was studied by Northern Blot-analyses. A hybridisation signal was only detected in the epididymis. In the dog this is definitely the site of highest expression of CE11 even though studies on other species indicate that it is probably not the only site of expression. Since canine thymus tissue was not available Northern Blot-analyses using total RNA of porcine and human thymus and other various tissues were performed. Still there was no hybridization signal observed in thymus RNA. A chemosynthetic CE11 peptide was obtained, comprizing a 30-mer epitope located in a cytoplasmatic loop between two transmembrane stretches. To verify the expression of the predicted protein, this oligopeptide was employed to raise antibodies. The putative CE11 protein was analysed by immunohistochemistry and Western blots using these polyclonal, anti-CE11-antipeptide antibodies. Immunohistochemical studies on cryotome sections of the canine epididymal corpus region revealed a membrane-associated staining on the apical side of the epididymal duct epithelial cells. Using membrane preparations of epdidiymal corpus tissue a specific immunoreactive signal could be detected by Western blot-analyses. Furthermore, it was demonstrated by PCR that CE11 mRNA was expressed by immortalized canine epididymal epithelial cells, a fact that will allow regulation studies in the future without performing experiments on animals.   Functional investigations were not subject of this thesis. However, the localisation and secondary structure of CE11 strongly suggest that it actually might act as a transporter between the epididymal epithelium and the duct lumen and therefore may play an important role concerning the sperm maturation and storage of the dog and some other species.  

Bei dem caninen Epididymis-Genprodukt CE11 handelt es sich um einen neuartigen 12-Transmembrandomänen-Cotransporter, der auf der apikalen Epithelzellmembran des Neben-hodenkanals lokalisiert ist. Alle bisher identifizierten epididymalen Transportproteine der apikalen Zellmembran sind an der Regulation des luminalen Flüssigkeitsmilieus beteiligt, welches für die Reifung und Lagerung der Spermien essentiell ist. Somit könnte auch CE11 eine wichtige Bedeutung für die Funktionalität des caninen Nebenhoden besitzen. Ziele der vorliegenden Arbeit waren die Ermittlung von neuen Sequenzdaten der CE11 cDNA in Richtung 5‘Ende, die Überprüfung auf ein offenes Leseraster anhand neu gewonnener Klone sowie dem Nachweis der mRNA und des putativen Proteins im Nebenhodengewebe und in Zellkulturen des Nebenhodenepithels. Die zum Teil bekannte Sequenz der CE11 cDNA konnte bestätigt und mit Hilfe der 5‘Inversen PCR vervollständigt werden. In allen Klonen fand sich eine durchgängiges offenes Leseraster. Die Suche in den Datenbanken ergab, dass die cDNA-Sequenz von CE11 eine signifikante Homologie zu zwei cDNA-Klonen aufweist, die aus dem Thymus von Maus und Mensch stammen und deren putatives Protein TSCOT (thymic stromal cotransporter) genannt wird. Weiterhin zeigte sich eine große Homologie zu zwei unvollständigen Klonen von Schwein und Rind, die aus gepooltem Gewebe, darunter auch Thymus, stammen. Laut verschiedener Strukturvorhersageprogramme kodiert CE11 sowie sein Gen-Homologes TSCOT für ein integrales Membranprotein mit 12-Transmembrandomänen. Strukturell ähneln sie Mitgliedern einer Na+/Ca2+-Transporter Familie aus der Klasse der ABC(ATP-Binding Cassette)-Proteine. Auf Sequenzebene weist CE11 die grösste Ähnlichkeit mit einem bakteriellen Tetrazyklin-Antiporter auf, der ebenfalls zur Klasse der ABC-Transporter gehört. In der CE11- bzw. TSCOT-Sequenz konnte jedoch kein ATP-bindender Sequenzbereich lokalisiert werden, so dass anzunehmen ist, dass es sich hierbei um Mitglieder einer neuartigen Klasse von 12-Transmembrandomänen-Transportern handelt. Die Untersuchung von CE11 auf RNA-Ebene erfolgte mittels nicht-radioaktiver Northern Blot Analyse. Bei Gewebevergleichen trat beim Hund nur im Nebenhoden ein Hybridisierungssignal auf. Auch wenn Studien an anderen Spezies darauf hinweisen, dass CE11 wahrscheinlich nicht nebenhodenspezifisch ist, kann davon ausgegangen werden, dass beim Hund hier ein Expressionsschwerpunkt liegt. Da kein canines Thymusgewebe beschafft werden konnte, wurden aufgrund der Datenbankergebnisse Northern Blot Analysen mit Gesamt-RNA aus Nebenhoden-, Thymus- und anderen Vergleichsgeweben von Schwein und Mensch durchgeführt. Es konnte jedoch kein Hybridisierungssignal im Thymus nachgewiesen werden. Zum Nachweis der Expression des vorhergesagten Proteins wurden polyklonale CE11 Antikörper verwendet. Diese wurden mit Hilfe eines chemosynthetischen Peptids hergestellt, welches ein 30-mer langes Epitop umfasst, das cytoplasmatisch zwischen zwei Transmembranregionen liegt. Der Nachweis erfolgte mittels Immunohistchemie und Western Blot-Analyse. Immunhistochemisch konnte auf Kryotomschnitten aus dem Corpusbereich des Hundeneben-hodens ein deutliches, membranassoziiertes Signal an der apikalen Seite der Epithelzellen der Nebenhodengänge gezeigt werden. In der Western Blot Analyse wurde CE11 im Nebenhoden eindeutig nachgewiesen Dazu wurden Membranpräparationen von caninen epididymalen Corpusgewebe verwendet. Es trat eine spezifische Bande auf, die bei Kompetition mit dem entsprechenden CE11-Oligopeptid verschwand. Weiterhin gelang es, die Transkription von CE11 in immortalisierten caninen Zelllen des Ne-benhodenepithels nachzuweisen und damit die Möglichkeit zu eröffnen, zukünftig Regulationsstudien zur CE11 Expression durchzuführen ohne auf Tierversuche angewiesen zu sein.   Funktionelle Untersuchungen waren nicht Gegenstand dieser Arbeit. Aufgrund seiner Lage und Sekundärstruktur kann allerdings angenommen werden, dass CE11 eine Transporterfunktion zwischen dem epididymalen Epithel und dem Lumen des Nebenhodenganges besitzt und damit möglicherweise eine wichtige Rolle bei der Spermienreifung bzw. –lagerung des Hundes und einiger anderer Spezies spielt.  

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Wingbermühle, Anke: CE11- ein neuartiger 12-Transmembrandomänen-Cotransporter des Hundenebenhodens. Hannover 2002. Tierärztliche Hochschule.

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