Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Identification of new genes in human polarized intestinal epithelial cells involved in transport of membrane proteins

Al-Bayati, Hiam Kamil Hameed

Intestinal genes whose expression is regulated during development and differentiation were identified and cloned from a Caco-2 cell library using a subtracted cDNA probe. In a total 2,016 clones were generated and individually transferred into microtiter plates. To determine differentially expressed genes in the library, 1,056 clones from the library were screened by colony hybridization using non-polar Caco-2 cDNA as a probe. A total of 560 clones gave signals in polar Caco-2 cells. Of these clones 220 clones had more than 400 bp and were used for further analysis.   Randomly selected 53 cDNA clones were sequenced and compared to the updated versions of nucleotide and protein database available in the Internet. Of these clones, 54% were of interest. The cDNA clone 432 showed 99% identity to the uncharacterized novel kidney protocadherin LKC cDNA (4,088 bp), the novel cDNA clone 530 showed 90% identity to a submitted cDNA sequence (656 bp), cDNA clone 203 showed 97% identity to DAD-1 protein (113 aa) and the cDNA clone 78 revealed 98% identity to brain BRI gene. Northern blot analysis showed an overexpression of these genes in polarized Caco-2 cells as compared to non-polarized cells.   The coding region of (Clone 432) pcLKC contains a signal sequence for the translocation in ER, maps to chromosome 5q35.2-q35.3 and consists of 31 exons. The pcLKC protein possesses eight cadherin repeats in the extracellular domain, a putative transmembrane domain, and a non-conserved cytoplasmic domain. The expression of the cDNA clone 432 was analyzed in MDCK cells, a prototype of epithelial cells, and revealed an overexpression in polarized cells as compared to non-polarized MDCK cells. This result suggests an implication of this gene in polarization events in epithelia.   Analysis of microarrays representative of several cDNA libraries isolated from cancerous and normal tissues demonstrated a significant 5.98-fold reduction in the expression of this gene in kidney tumours, and an ~3-fold reduction in colonic and stomach tumours. This suggests that clone 432 plays a role in maintaining an organized and intact epithelial layer and could prevent tumour progression. Furthermore, anti-sense analysis in polarized Caco-2 cells suggested a role of this gene on the polarized sorting of the sucrase-isomaltase.   Clone 530 was found to have a ubiquitous expression in human tissues. Unlike the case for clone 432, a significant reduction in the expression of clone 530 was observed only in breast cancer.   The homology of clone 530 to a submitted Homo sapines brain cDNA (656 bp) revealed an ORF consisting of 66 aa with a 33.3% predicted ER localization. This gene maps to chromosome 6. A fusion construct with pEGFP was created to observe the subcellular localization of this gene in living COS-1 cells. Confocal microscopy showed a cytosolic expression. However, further analysis of clone 530 by multiple tissue Northern blot strongly suggested that the predicted 66 aa are only a part of the full-length protein that encompasses a transcript of approximately 1 kb.   Clone 203 showed 97% homology to DAD-1 protein (113 aa). The complete reading frame of this gene was fused to a pEGFP reporter gene and transfected in living COS-1 cells. Confocal microscopy showed a cytosolic expression, in contrast to the results of Kelleher and Gilmore (1997). The cytosolic localization of this protein in COS-1 cells is not clear but it might be due to misfolding of the proteins during cloning into pEGFP vectors.   In summary, the genes 432, 530, 78 and 203 encode potential protein candidates that may be implicated in the modulation of protein trafficking in epithelial cells and in the regulation of cell differentiation.  

Mittels einer subtrahierten cDNA-Sonde wurden intestinale Gene, deren Expression während ihrer Entwicklung und Differenzierung reguliert wird, identifiziert und aus einer Caco-2-Zellbank kloniert. Insgesamt wurden 2016 Klone erzeugt und einzeln in Mikrotiterplatten übertragen. Um unterschiedlich exprimierte Gene in der Bank zu bestimmen, wurden 1056 Klone der Bank durch Koloniehybridisierung mit nicht-polarer Caco-2-cDNA als Sonde gescreent. Insgesamt 560 Klone wurden in polaren Caco-2-Zellen nachgewiesen. Von diesen Klonen hatten 220 mehr als 400 bp und wurden für die nachfolgenden Analysen verwendet.   Es wurden 53 zufällig gewählte cDNA-Klone sequenziert und mit den im Internet verfügbaren aktualisierten Versionen von Nukleotid- und Protein-Datenbanken verglichen. 54% dieser Klone erwiesen sich als interessant für eine weitergehende Untersuchung. Der Klon 432 hatte eine 99%-ige Übereinstimmung mit der LKC-cDNA (4088 bp) des noch uncharakterisierten neuartigen Nierenprotocadherins LKC, und Klon 530 stimmte zu 90% mit einer cDNA-Sequenz (656 bp) überein, während cDNA-Klon 203 eine 97%-ige Übereinstimmung mit dem DAD-1-Protein (113 AS) aufwies, und der cDNA-Klon 78 zeigte eine 98%-ige Homologie mit dem-BRI-Gen aus dem Gehirn. Die Northern-Blot-Analyse zeigte in polarisierten Caco-2-Zellen eine Überexpression dieser Gene im Vergleich zu nicht-polarisierten Zellen.   Die kodierende Region der pcLKC (Klon 432) beinhaltet eine Signalsequenz für die Translokation des Gens in das ER. Das Gen pcLKC entstammt dem Bereich 5q35.2-q35.3 und besteht aus 31 Exons. Die Expressiven des cDNA-Klon 432 wurde in MDCK-Zellen, einen Prototype von epithelialen Zellen, untersucht und es ergab sich eine 95% Überexpression in polarisierten Zellen verglichen mit nicht polarisierten MDCK-Zellen. Dieses Ergebnis macht die Beteiligung des Gens bei der Polarisation in Epithelialzellen deutlich.   Mit Hilfe der Microarray Analyse wurde bei einem Vergleich von an Krebs erkrankten und gesunden Gewebe ein Rückgang der Genexpression dieses Gens um das Fünffache in Nierentumouren und um das Dreifache in Dickdarm- und Magentumoren beobachtet. Dieses Ergebnis lässt Rückschlüße auf die Rolle des Protocadherins bei der Erhaltung einer intakten und organisierten Epithelischicht und der möglichen Unterbindung einer Tumorfortentwicklung zu. Die Anti-Sense-Analyse in polarisierten Caco-2 Zellen lässt ferner vermuten, dass dieses Gen einen Einfluss auf die polarisierte Sortierung der Saccharase-Isomaltase zur apikalen Membran hat.   Der Klon 530 zeigte ein ubiquitäres Expressionsmuster. Im Gegensatz zu Klon 432 konnte hier eine signifikante Reduktion des Gens in Brustkrebsgwebe beobachtet werden.   Die Homologie-Analyse von Klon 530 mit der BRI-cDNA (656 bp) wies einen ORF von 66 AS auf, der mit einer Warscheinlichkeit von 33, 3% im ER lokalisiert ist. Das Gen befindet sich auf Chromosom 6. Um die genaue subzelluläre Lokalisation des Gens zu bestimmen, wurde ein Fusionsprotein aus Klon 530 und dem grün fluoreszierenden Reportergen pEGFP kreiert. Dieses wurde in lebende COS-1 Zellen transfiziert, Und per konfokaler Lasermikroskopie untersucht. Hierbei wurde deutlich, daß Klon 530 ein cytosolisches Expressionsmuster zeigte. Die hier aufgeführten Ergebnisse weisen stark auf einen unvollständigen ORF des Klon 530 hin. Es wird angenommen, dass sich die vollstandige Transkriptlänge des ORF in Bereich von 1 kb bewegen sollte. Klon 203 hatte eine 97%-ige Homologie mit dem DAD-1 Protein. Der komplette Leserrahmen (ORF) dieses Gens wurde mit dem Reportergen pEGFP fusioniert und die Lokalisation des Gens in COS-1 Zellen untersucht. Auch hier ergab sich eine cytosolische Expression des Gens. Da dieses Expressionmuster ungwöhnlich ist und nicht mit bereits beschriebenen Experimenten von Kelleher and Gilmore (1997) übereinstimmt, wird eine Missfaltung des Proteins, etwa- ausgelöst durch Klonierung in die Expressionvektoren, nicht ausgeschlossen.   Zusammenfassend kann angenommen werden, dass die Gene 432, 530, 78 und 203 potentiell für Proteine stehen, die am Protein-Trafficking in Epithelzellen beteiligt sind und eine wichtige Rolle bei der Regulation der Zelldifferenzierung einnehmen.  

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Al-Bayati, Hiam Kamil Hameed: Identification of new genes in human polarized intestinal epithelial cells involved in transport of membrane proteins. Hannover 2002. Tierärztliche Hochschule.

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