Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Einfluss von Retinoiden auf die Differenzierung und Permeabilität der Caco-2 Zellkultur als Modell für die Gastrointestinale Barriere

Baltes, Steffen

Retinoids are essential for a large variety of biological processes, including the differentiation of epithelia. It has been shown by studies in developing countries, that vitamin A deficiency is accompanied by gastrointestinal disorders, for instance an increase in intestinal permeability. The relation of vitamin A supply and intestinal integrity respectively the differentiation of epithelia has been shown widely in vivo as well in vitro. These structures in the intestinal tract limiting the intake of molecules and microorganisms are regarded as a functional complex and termed "gastrointestinal barrier". The epithelial permeation of water soluble compounds mainly occurs via the paracellular pathway. The limiting structure is the tight junctions - cell contact structures between the enterocytes - that are synthesized and assembled during the differentiation. The degree of tight junction permeability is called the "paracellular permeability". Tissues are supplied with retinoids in the form of retinol, which is stored in the liver and distributed by blood circulation. Retinol is metabolized intracellularly to its biologically active form retinoic acid. Due to intestinal intake of vitamin A with the food and the subsequent direct metabolisation of retinol to retinoic acid in the enterocyte, the intestinal epithelium may be regarded as very efficiently supplied with retinoids. Assuming this efficient supply, the basic aim of this work was to investigate if retinoids influence the differentiation of the intestinal epithelium and therefore the function of the tight junctions. Retinoids mediate most of their functions via ligand activated nuclear transcription factors. Two families of the retinoid receptors are known: retinoid acid receptor RAR and the retinoid X receptor RXR. Each has three subtypes a, b and g, which show a highly tissue specific distribution pattern, binds specific ligands and usually act as RAR-RXR-heterodimers. RXR is known to interact with other nuclear receptors, for instance with the vitamin D-receptor (VDR) or the peroxisome proliferator activated receptor (PPAR) and also mediates synergistic effects. The second aim of this work was to investigate the mode of action of retinoid receptors concerning subtype and dimer conformation in the context of differentiation of the intestinal epithelium and tight junction assembly. In the study presented here, Caco-2 cells were used as a modell for the gastrointestinal barrier. Caco-2 cells originate from a colonic adenocarcinoma. In culture, after they reach confluency they spontaneously differentiate into enterocyte-like cells regarding their morphological and functional characteristics forming tight junctions or a brush border membrane. The degree of morphological and functional differentiation was monitored by determining the specific activity of the marker enzyme Intestinal Alkaline Phosphatase IAP. This hydrolase is bound to the brush border membrane and its activity is related to the degree of cell differentiation. Enzyme assays and semiquantitative RT-PCR were performed. By culturing the cells on permeable filters, it is possible to simulate the gastrointestinal barrier with a lumen side, the epithelium and a blood side. This system was used to investigate the paracellular permeability of Caco-2 cells by measuring the transepithelial electric resistance and the apical-basolateral flux of radiolabelled mannitol. Additionally mRNA expression of the most important tight junction components occludin, ZO-1 and claudins-1 to -4 was measured. For the investigation of the role of retinoid receptors concerning subtype and dimer conformation, synthetic specific receptor ligands were used. Most of the experiments were performed by culturing Caco-2 cells in serum free media in order to ensure retinoid free basal conditions and in order to be able to monitor the effects of trace amounts of retinoids.   The following results were obtained: Retinoids enhance the specific activity of IAP in a time and dose dependent manner. The mRNA levels of IAP are elevated by retinoic acid. Treatment of the Caco-2 monolayer with retinoids in serum free media causes an increase of paracellular permeability. mRNA levels of occludin, claudin-3 and claudin-4 are reduced while mRNA levels of claudin-1 (partly) and claudin-2 are elevated. No influence was observed on ZO-1. The effects of retinoic acid on the differentiation of the Caco-2 cell culture are mediated by  RAR-RXR-heterodimers. RXR must apparently be activated by a specific ligand. No synergistic effects mediated by RXR were observed. Various receptor conformations showed similar effects on the specific activity of IAP. The following conclusions were drawn: Retinoids promote the differentiation of the intestinal epithelium. They play a role in the tight junction gene expression and influence the development of the intestinal permeability properties. The entire range of retinoid action require certain additional factors that maybe missing under serum free culture conditions. Among these factors could be cytokines or growth factors. Retinoid controlled gene regulation in the intestine may also be regulated by alternative substances. In that case, vitamin A deficiency would remain without consequences until the deficiency became more severe or until other nutrients are scarce.  

Retinoide sind essenziell für die Aufrechterhaltung einer Vielzahl von Prozessen im Organismus von Mensch und Tier, so auch für die Differenzierung von Epithelien. Aus Studien in Entwicklungsländern ist bekannt, dass ein Vitamin A-Mangel mit erheblichen Störungen des Darmtraktes, unter anderem mit einer erhöhten Durchlässigkeit der Schleimhaut, einhergeht. Auch im Tierversuch sowie in vitro konnte der Zusammenhang zwischen Vitamin A-Versorgung und Darmgesundheit einerseits sowie der Differenzierung von Epithelien andererseits demonstriert werden. Die Strukturen der Darmschleimhaut, die die Aufnahme von Fremdstoffen und -organismen begrenzen, werden als Funktionskomplex gesehen und als "Gastrointestinale Barriere" bezeichnet. Die Passage von wasserlöslichen Substanzen durch das Epithel der Darmschleimhaut, findet zu einem Großteil auf dem parazellulären Wege statt. Die begrenzende Struktur für diesen Weg und somit eine Komponente der Gastrointestinalen Barriere stellen die Tight Junctions dar - Zellkontakte zwischen den Epithelzellen der Darmschleimhaut. Deren Bildung ist ein Teil des Differenzierungsprozesses. Das Maß der Durchlässigkeit der Tight Junctions wird als "parazelluläre Permeabilität" bezeichnet. Üblicherweise erfolgt die Versorgung der Gewebe mit Retinoiden über den Blutkreislauf in Form des Retinols, welches in der Leber gespeichert ist. Dieses Retinol wird in den Zielgeweben in die biologisch aktive Form der Retinoide, die Retinsäuren umgewandelt. Da Vitamin A mit der Nahrung über die Darmschleimhaut aufgenommen wird und kürzlich gezeigt werden konnte, dass in den Epithelzellen des Dünndarmes selbst eine Verstoffwechselung von Retinol zu all-trans-Retinsäure existiert, ist von einer besonders effizienten Versorgung des Dünndarmepithels mit Retinoiden auszugehen. Auf Grundlage dieser effizienten Versorgung sollte mit der vorliegenden Arbeit untersucht werden, ob und wie Retinoide in der Nahrung den Differenzierungsprozess des Dünndarmepithels und die Bildung der Tight Junctions beeinflussen. Retinoide vermitteln ihre biologische Wirkungen zumeist in Form der Retinsäuren über Liganden aktivierte nukleäre Transkriptions-Faktoren. Es gibt zwei Familien von Retinoid-Rezeptoren, die Retinsäure-Rezeptoren (RAR) und die Retinoid X Rezeptoren (RXR), die jeweils in drei Subtypen (a, b und g) vorkommen und üblicherweise als RAR-RXR-Heterodimere wirken. Jeder Subtyp weist ein organspezifisches Verteilungsmuster auf und bindet spezielle Liganden. Der Retinoid-X-Rezeptor kann mit anderen Rezeptoren interagieren, beispielsweise dem Vitamin D-Rezeptor (VDR) oder dem Peroxisomen-Proliferator aktivierten Rezeptor (PPAR), und im Zusammenwirken mit diesen synergistische Effekte vermitteln. Mit der vorliegenden Arbeit sollten molekulare Mechanismen im Hinblick auf beteiligte Rezeptoren und -Subtypen und deren Konformation im Differenzierungsprozess des Dünndarmepithels sowie bei der Bildung der Tight Junctions untersucht werden.   Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit wurden an Caco-2 Zellen, einem Modell für die Gastrointestinale Barriere durchgeführt. Caco-2 Zellen haben ihren Ursprung in einem Kolonkarzinom und sind dadurch charakterisiert, dass sie nach Erreichen eines konfluenten Monolayers spontan beginnen, sich von undifferenzierten Tumorzellen zu Zellen zu differenzieren, die in morphologischer und funktioneller Hinsicht den Epithelzellen des Dünndarmes gleichen. Sie bilden beispielsweise Tight Junctions oder die für Dünndarm-Epithelzellen charakteristische Bürstensaummembran. Der Differenzierungsprozess wurde anhand eines Markerenzyms, der Intestinalen Alkalischen Phosphatase (IAP) untersucht. Dieses Enzym ist an die Bürstensaummembran gebunden und seine spezifische Aktivität korreliert mit dem Grad der Differenzierung der Zelle. Es wurden Enzym-Aktivitäts-Assays durchgeführt und die Genexpression der IAP mittels semiquantitativer RT-PCR untersucht. Die Bildung der Tight Junctions wurde auf zwei Arten untersucht. Zum einen wurden Caco-2 Zellen dazu auf permeablen Filtermembranen kultiviert. An diesem System, welches einer Nachbildung der Verhältnisse im Darm mit einer Lumenseite, einer Blutseite und dem trennenden Epithel entsprach, wurde die parazelluläre Permeabilität in Form des transepithelialen elektrischen Widerstandes (TEER) und der zeitlich bezogenen apikal-basolateralen Diffusion von radioaktiv markiertem Mannitol bestimmt. Zum anderen wurde die Genexpression der Tight Junction-Proteine Occludin, ZO-1 und Claudin-1 bis -4 mittels semiquantitativer RT-PCR untersucht. Um Hinweise auf Mechanismen in Hinblick auf beteiligte Rezeptoren und Subtypen, Dimer-Konformation und Synergismen zu erhalten, wurden spezifische synthetische Liganden der möglichen beteiligten Rezeptoren eingesetzt. Für einen Großteil der Versuche wurden die Caco-2 Zellen in serumfreiem Medium kultiviert, um definierte Retinoid freie Kulturbedingungen zu erhalten und die Wirkung der Retinoide auch in geringsten Konzentrationen isoliert bestimmen zu können.   Bei den Untersuchungen wurden folgende Ergebnisse erzielt: Retinoide haben auf die spezifische Aktivität des Differenzierungmarkers Intestinale Alkalische Phosphatase in Caco-2 Zellen einen Konzentrations abhängigen steigernden, mit zunehmendem Differenzierungsgrad der Zellen abnehmenden Einfluss. Die mRNA der IAP wird unter dem Einfluss von all-trans-Retinsäure vermehrt exprimiert. Die Behandlung des Caco-2 Monolayers unter serumfreien Kulturbedingungen mit Retinoiden bewirkt eine gesteigerte parazelluläre Permeabilität. Occludin, Claudin-3 und Claudin-4 werden vermindert exprimiert. Claudin-1 (in der frühen Kulturphase) und Claudin-2 werden vermehrt exprimiert. Auf die Genexpression von ZO-1 konnte kein Einfluss festgestellt werden. All-trans-Retinsäure wirkt im Rahmen des Differenzierungsprozesses der Caco-2 Zellkultur über ein RAR-RXR-Heterodimer in dem anscheinend RXR durch einen spezifischen Liganden aktiviert sein muss. Es konnten keine Synergismen von spezifischen RXR-Liganden im Zusammenwirken mit spezifischen RAR-, PPAR- und VDR-Liganden gezeigt werden. Unterschiedliche Rezeptor-Konformationen hatten teilweise einen ähnlichen Einfluss auf die IAP.   Es wurde folgende wesentliche Schlüsse gezogen: Retinoide fördern den Differenzierungsprozess des Dünndarmepithels. Retinoide sind prinzipiell an der Regulation der Genexpression von Tight Junction-Proteinen beteiligt und haben Einfluss auf die Entwicklung der parazellulären Permeabilitäts-Eigenschaften. Zur Entfaltung der vollen Wirkung der Retinoide sind weitere Faktoren erforderlich, die möglicherweise unter serumfreien Kulturbedingungen nicht vorhanden sind oder nicht gebildet werden. Diese Faktoren könnten Wachstumsfaktoren oder Zytokine sein. Retinoid kontrollierte Genexpressions-Mechanismen im Darm können möglicherweise auch durch alternative Substanzen kontrolliert werden. Dies würde bedeuten, dass eine Beeinträchtigung der Barrierefunktion des Darmes erst bei schwereren Fällen von Vitamin A-Defizienz in Verbindung mit einer allgemeinen Unterernährung zutage tritt.  

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Baltes, Steffen: Einfluss von Retinoiden auf die Differenzierung und Permeabilität der Caco-2 Zellkultur als Modell für die Gastrointestinale Barriere. Hannover 2002. Tierärztliche Hochschule.

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