Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Charakterisierung der porcinen Zona pellucida und ihrer Veränderungen während der In-vitro-Maturation

Ebeling, Silja

Ziel dieser Arbeit war es, die porcine Zona pellucida (ZP) näher zu charakterisieren, mit besonderem Blick auf mögliche biochemische und funktionelle Veränderungen während der In-vitro-Maturation. Als Untersuchungsmaterial standen Ovarien zahlreicher frisch geschlachteter Jungsauen zur Verfügung. Nach der Gewinnung der Oozyten wurde entweder die ZP direkt isoliert oder die Oozyten wurden zunächst einer In-vitro-Maturation unterzogen. Die drei Glykoproteine der porcinen Zona pellucida wurden mittels ein- und zweidimensionaler Polyacrylamidgelelektrophrose (1D- u. 2D-PAGE) aufgetrennt. Es folgte eine immunologische und lektinologische Analyse der durch die PAGE separierten Glykoproteine der ZP. Diese Studien wurden sowohl mit ZP ungereifter als auch gereifter Oozyten durchgeführt. Weiterhin wurde ebenfalls mittels Lektinen die Verteilung der Kohlenhydratketten über die Oberfläche der ZP in rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen von intakten Oozyten untersucht. Zur Klärung funktioneller Aspekte innerhalb der Veränderungen der ZP während der In-vitro-Maturation wurde ein Spermien-ZP-Bindungstest entwickelt. Mit diesem konnte die Induzierbarkeit der Akrosomreaktion vergleichend von ZP ungereifter und gereifter Oozyten untersucht werden. Der akrosomale Status der Spermien wurde mit dem Lektin PNA, das an einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt war, ermittelt. Für die Bindungstests wurden Frischejakulate eines institutseigenen Ebers und kryokonservierte Nebenhodenspermien einer Charge verwendet. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: In der 2D-PAGE wurde bei der ZP von gereiften Oozyten im Vergleich zur Auftrennung von ungereiften ein pI-Shift von ca. einer pI-Einheit festgestellt. Diese Zunahme der Acidität stellt sich mit einer Differenz von ca. zwei pI-Einheiten innerhalb der lektinologischen Analyse noch deutlicher dar. Im Lektinblot konnte gezeigt werden, dass mannosehaltige Strukturen innerhalb von diantennären Seitenketten ausgeprägt im Glykoprotein ZPA vorliegen und bei ZPB/ZPC durch Con A nicht erkannt werden. Mit SNA, MAA II und ACA wurde unterschiedlich verknüpfte Sialsäure nachgewiesen. Durch das Lektin AAA konnte der für das Schwein typische hohe Fukosylierungsgrad der ZP nachvollzogen werden. Ein negatives Ergebnis in der lektinologischen Untersuchung erhielt man nur für den Nachweis von terminaler Galaktose (PNA u. GS I). Das ermittelte Lektinbindungsverhalten wies keine Unterschiede bei ungereifter und gereifter ZP auf. Innerhalb der rasterelektronenmikroskopischen Analysen konnte das Mengenverhältnis von Con A und AAA positiven Strukturen aus dem Lektinblot bestätigt werden. Es konnte weiterhin nachgewiesen werden, dass die ZP während der In-vitro-Maturation Prozessen unterliegt, die eine Funktionsänderung hervorrufen. Die In-vitro-Reifung bewirkte statistisch signifikant eine beschleunigte Induktion der Akrosomreaktion durch die ZP. Dies wurde für die ersten zehn Minuten nach der Bindung der Spermien an die ZP gezeigt. Nach weiteren zehn Minuten erfolgte eine Angleichung an die Verhältnisse bei der ungereiften ZP. Diese Ergebnisse zeigen, dass die ZP schon während der Maturation und nicht erst nach der Fertilisation nachweisbaren Veränderungen unterliegt. Bezüglich des pI-Shifts konnten keine Hinweise erhoben werden, dass dieser durch veränderte Kohlenhydratstrukturen oder eine vermehrte Sialylierung bewirkt wird. Die erhöhte Acidität der ZP Glykoproteine von gereiften Oozyten könnte durch eine gesteigerte Sulfatierung hervorgerufen werden. Dies ist in weiterführenden Untersuchungen abzuklären. Weiterhin muss überprüft werden, inwiefern sich diese Ergebnisse vom In-vitro-Modell auf die Verhältnisse in vivo übertragen lassen und ob dort noch umfangreichere Veränderungen auftreten.

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Ebeling, Silja: Charakterisierung der porcinen Zona pellucida und ihrer Veränderungen während der In-vitro-Maturation. Hannover 2002. Tierärztliche Hochschule.

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