Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Molekulare Grundlagen der Resistenz gegenüber Sulfonamiden, Streptomycin und Chloramphenicol bei Bakterien der Genera Pasteurella und Mannheimia unter besonderer Berücksichtigung der Identifizierung von Resistenzgenclustern

Kehrenberg, Corinna

Despite the large number of Pasteurella (P.) and Mannheimia (M.) isolates of bovine and porcine origin being resistant to sulfonamides (Sul), streptomycin (Sm) and chloramphenicol (Cm), little is known about the genetic basis of these resistances in Pasteurella and Mannheimia. The aim of the present study was to conduct detailed studies with regard to the structure and the localization of the respective resistance genes, their transferability and their possible organization in clusters. The results of this study were expected to provide valuable informations on the spread of the resistance genes via horizontal gene transfer on one hand, but also on their simultaneous occurrence in unrelated isolates and their persistence as the result of co-selection on the other hand. The genes sul2, catA3 and strA were identified to be responsible for the expression of the resistance phenotypes SulRSmR or SulRSmRCmR in all 30 Pasteurella and Mannheimia isolates included in this study. These genes were the first and so far only known Sul, Cm and Sm resistance genes described in isolates of P. aerogenes, M. varigena, M. glucosida and M. taxon 10. Specific PCR assays were established for the detection of the genes sul2, catA3 and strA. Different combinations of the primers also enabled their use for a fast and efficient detection of sul2-strA, strA-sul2 and sul2-catA3-strA resistance gene clusters. All three types of resistance gene clusters were detected in the chromosomal DNA as well as on plasmids. Five different types of SulRSmRCmR plasmids and three different types of SulRSmR plasmids could be differentiated. The plasmids pMVSCS1 from M. varigena and pMHSCS1 from M. taxon 10 were sequenced completely. Sequence analyses identified for the first time the organization of the three resistance genes as a sul2-catA3-strA resistance gene cluster in Pasteurella and Mannheimia. The comparison between the so far known sul2-strA spacer sequences and the sequences up- and downstream of the gene catA3 led to the identification of presumable recombination sites. Moreover, a model which explains the integration of the catA3 gene into the sul2-strA spacer region by illegitimate recombination via these recombination sites has been derived. Analysis of plasmid pSTOJO1 identified for the first time the complete sequence of a dfrA14 gene cassette involved in trimethoprim resistance. This gene cassette was 586 bp in size. Instead of its integration in a class 1 integron, it was integrated at a secondary site in a strA gene. This example showed another possibility of integrating a functionally active resistance gene into a sul2-strA resistance gene cluster. The presence of the genes sul2, strA and catA3 on plasmids or in the chromosomal DNA of Pasteurella and Mannheimia isolates of different animal origin underlines the widespread occurrence and the dissemination of these resistance genes. The proof of their organization in resistance gene clusters explains why many Pasteurella and Mannheimia isolates are simultaneously resistant to either Sul and Sm or to Sul, Sm, and Cm. Co-selection in the presence of one such antimicrobial agent ensures the stable maintenance of all genes of the respective cluster and explains the widespread occurrence of these resistance genes among unrelated Pasteurella and Mannheimia isolates. Moreover, the identification of a catA3 gene in a sul2-catA3-strA resistance gene cluster provides an explanation for the persistence of this resistance gene even after a long-term ban of Cm from use in pigs and cattle. It also demonstrates the difficulty of getting rid of resistance genes which are part of a widely distributed resistance gene cluster.  

Trotz hoher Resistenzraten boviner und porciner Pasteurella (P.)- und Mannheimia (M.)-Isolate gegenüber Sulfonamiden (Sul), Streptomycin (Sm) und Chloramphenicol (Cm) ist bislang nur wenig über die genetischen Grundlagen entsprechender Resistenzeigenschaften bei Pasteurella und Mannheimia bekannt. Ziel der vorliegenden Studie war daher die Durchführung von detaillierten Untersuchungen zur Struktur und Lokalisation der Resistenzgene, zu deren Transfermöglichkeiten und zu einer möglichen Verknüpfung der Resistenzgene. Die Ergebnisse dieser Studie sollten einerseits Rückschlüsse auf die Verbreitung der Resistenzgene über horizontale Gentransferprozesse, andererseits aber auch auf ihr gemeinsames Auftreten und ihre Persistenz als Folge von Co-Selektionsprozessen ermöglichen. Die Gene sul2, catA3 und strA wurden bei allen in die Untersuchung einbezogenen 30 Pasteurella- und Mannheimia-Isolaten für die Ausprägung der Resistenzphänotypen SulRSmR oder SulRSmRCmR identifiziert. Dabei stellten die sul2-, catA3- und strA-Gene die ersten und bislang einzigen bei P. aerogenes, M. varigena, M. glucosida und M. Taxon 10 nachgewiesenen Sul-, Cm- und Sm-Resistenzgene dar. Zum Nachweis der Gene sul2, catA3 und strA wurden spezifische PCR-Assays etabliert. Durch die Auswahl der Primer und durch eine neuartige Kombination dieser Primer wurden genübergreifende PCR-Analysen möglich, die einen schnellen und effizienten Nachweis von sul2-strA-, strA-sul2- und sul2-catA3-strA-Resistenzgenclustern erlaubten. Alle drei Typen von Resistenzgenclustern wurden in der chromosomalen DNA, aber auch auf Plasmiden nachgewiesen. Im letzteren Fall ließen sich fünf SulRSmRCmR-Plasmidtypen und drei SulRSmR-Plasmidtypen unterscheiden. Die SulRSmRCmR-Plasmide pMVSCS1 aus M. varigena und pMHSCS1 aus Mannheimia Taxon 10 wurden komplett sequenziert. Durch die Sequenzanalysen konnte erstmalig bei Pasteurella und Mannheimia eine Verknüpfung der drei Resistenzgene zu einem sul2-catA3-strA-Resistenzgencluster nachgewiesen werden. Durch einen Vergleich der Sequenzen zwischen den bislang bekannten sul2-strA-Spacerregionen und den das Gen catA3 flankierenden Arealen ließen sich mögliche Rekombinationsstellen nachweisen. Unter Verwendung dieser Rekombinationsstellen wurde ein Modell erstellt, das die Integration des catA3-Gens mittels illegitimer Rekombination in die sul2-strA-Spacerregion erklärt. Bei der Analyse des Plasmids pSTOJO1 konnte zum ersten Mal die komplette Sequenz einer 586 bp umfassenden Trimethoprimresistenz vermittelnden dfrA14-Genkassette identifiziert werden. Statt in einem Klasse 1 Integron befand sich diese Genkassette an einer sekundären Stelle in einem strA-Gen integriert. Dieses Beispiel zeigt eine weitere Möglichkeit für die Integration eines funktionell aktiven Resistenzgens in ein sul2-strA-Gencluster auf. Das Vorkommen der Resistenzgene sul2, strA und catA3 auf Plasmiden und in der chromosomalen DNA von Pasteurella- und Mannheimia-Isolaten unterschiedlicher tierartlicher Herkunft spricht für ihre weite Verbreitung und leichte Übertragbarkeit. Der Nachweis der Verknüpfung dieser Resistenzgene erklärt, warum viele Pasteurella- und Mannheimia-Isolate Resistenz gegenüber zwei (Sul, Sm) oder allen drei untersuchten antimikrobiellen Wirkstoffen (Sul, Sm, Cm) zeigen. Co-Selektion in Gegenwart eines der Wirkstoffe stellt dabei eine Erklärung für die weite Verbreitung dieser Resistenzgene bei unverwandten Pasteurella- und Mannheimia-Isolaten dar. Zudem bietet der Nachweis des catA3-Gens in einem sul2-catA3-strA-Resistenzgencluster eine plausible Erklärung für die Persistenz dieses Resistenzgens nach einem langjährigen Anwendungsverbot des Wirkstoffes und unterstreicht somit das Problem, Resistenzgene, die Bestandteile von weit verbreiteten Resistenzgenclustern darstellen, wieder zu eliminieren.  

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Kehrenberg, Corinna: Molekulare Grundlagen der Resistenz gegenüber Sulfonamiden, Streptomycin und Chloramphenicol bei Bakterien der Genera Pasteurella und Mannheimia unter besonderer Berücksichtigung der Identifizierung von Resistenzgenclustern. Hannover 2002. Tierärztliche Hochschule.

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