Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Molekulare Grundlagen des defekten Transports eines Glycoproteins bei der Pathogenese der Congenitalen Saccharase-Isomaltase Defizienz (CSID)

Ritz, Valentina

Correct protein transport and efficient folding are prerequisites for physiological functions in eukaryotic organisms. Alterations in these processes may lead to pathological phenomena with tremendous perspectives for the affected organism. Known diseases based on this mechanisms are e.g. Cystic Fibrosis or some lysosomal storage diseases like Morbus Gaucher. Milder symptoms are encountered in Congenital Sucrase Isomaltase Deficiency (CSID) which causes osmotic diarrhea and abdominal cramps upon ingestion of sugar. Six phenotypes of this clinically relevant and autosomal-recessive inherited disease have been characterized biochemically and by immunohistological techniques. The aim of this project was the identification of the molecular mechanisms underlying a phenotype of CSID, in which biochemical and morphological data revealed that the SI-precurser does not acquire transport competence and persists as a mannose rich polypeptide in the ER. Methods included isolation of SI-cDNA by RT-PCR, identification of the mutations and their introduction into the wildtype SI gene through site-directed mutagenesis and their expression in different mammalian cell systems. Three point mutations in the patient’s cDNA could be detected by sequencing the DNA. A Valine to Phenylalanine substitution at residue 15 within the membrane anchoring domain was not further analysed, since this domain acts also as a signal sequence in the type II SI protein indicating that this mutation would generate a cytosolic protein and this was not the case. An exchange of Glutamine to Glutamic acid (Q1203E) was already described as polymorphism. An A to T exchange of nucleotide 705 within the isomaltase domain led to a amino acid substitution of Alanine to Threonine at position 231 of the isomaltase subunit (A231T). Introduction of this mutation in the wild type SI gene revealed no effect on the folding, enzymatic activity and stability as compared to wild type SI. A novel pathomechanism could be postulated implicating the A231T mutation in the generation of a secretory form of SI. It is also likley, that a more complex mechanism exists involving two or more mutations that act synergistically. Two mutations which appeared only once during sequencing seemed to be of pathophysiological interest because they generated a switch to the amino acid proline. First, both mutations (L620P and L702P) are located within a conserved region and second, both mutations  resulted in a ER block of SI. Furthermore, these mutations suggest an important role of the relevant domains in the overall folding of SI. This work contributes to elucidate the molecular mechanisms underlying intracellular protein transport using a pathological disorder as a model.  

Ein korrekter Proteintransport und eine effiziente Proteinfaltung sind Voraussetzung für physiologische Zellfunktionen in eukaryontischen Organismen. Fehler in diesen Vorgängen führen zu pathologischen Veränderungen, die für den betroffenen Organismus häufig schwerwiegende Folgen haben können. Bekannte Krankheiten, die auf dieser Grundlage beruhen, sind z.B. die Cystische Fibrose oder eine Reihe lysosomaler Speicherkrankheiten wie bei Morbus Gaucher. Mildere Symptome werden bei der Congenitalen Saccharase-Isomaltase-Defizienz (CSID) beobachtet, einer Erkrankung, die für die betroffenen Patienten im klinischen Verlauf mit osmotischer Diarrhoe und abdominalen Krämpfen nach Aufnahme von Zucker einhergeht. Bei dieser klinisch relevanten, autosomal-rezessiv vererbten Krankheit wurden bisher sechs Phänotypen biochemisch und immunhistologisch charakterisiert. Zielsetzung dieses Projekts war die Aufklärung der zugrundeliegenden molekularen Mechanismen eines Phänotypen der CSID, bei dem durch biochemische und morphologische Charakterisierung bereits festgestellt wurde, daß der mannosereich glykosylierte Vorläufer der Saccharase-Isomaltase (SI) keine Transportkompetenz erlangt und im ER akkumuliert. Die Methodik der Arbeit umfasste die Isolierung der SI-cDNA mittels RT-PCR, die Identifikation der Mutanten, den Austausch der relevanten Basenpaare im Wildtyp-Protein mittels Oligonukleotid-gerichteter Mutagenese und dessen Expression in verschiedenen Säugetierzellen. Durch Sequenzieren konnten 3 signifikante Mutationen in der cDNA des Patienten nachgewiesen und verifiziert werden. Ein Austausch von Valin zu Phenylalanin an Position 15 im Bereich des Membranankers (V15F) wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht charakterisiert, da diese Domäne auch als Signalsequenz im Typ II SI-Protein fungiert. Es wurde angenommen, daß diese Mutation ein zytosolisch lokalisiertes Protein bedingen würde. Ein Austausch von Glutamin zu Glutaminsäure (Q1203E) ist bereits als Polymorphismus beschrieben worden. Eine A/T Mutation an Nukleotid 705 im Bereich der Isomaltase führte zu einem Alanin zu Threonin Austausch an Position 231 der pro-SI (A231T). Die Einführung dieser Mutation zeigte keine Auswirkung auf Transportverhalten, Faltung, enzymatischer Aktivität und Stabilität im Vergleich zum Wildtyp-Protein. Ein neuer Pathomechanismus konnte postuliert werden, bei dem die A231T Mutante eine sekretorische Form der SI generiert. Es ist genauso wahrscheinlich, daß ein komplexerer Mechanismus vorliegt, bei dem zwei oder mehrere Mutationen synergistisch wirken. Zwei Mutationen, die nur einmal nachgewiesen wurden, erschienen aufgrund des Aminosäureaustauschs (Leucin zu Prolin) pathophysiologisch interessant. Zum einen lagen beide Mutationen (L620P und L702P) in einer konservierten Region, zum anderen führten beide Mutationen zu einem Transportblock der SI im ER. Diese Mutationen zeigen die wichtige Rolle der relevanten Domänen in der Faltung der SI. Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen dazu bei, die molekularen Mechanismen des intrazellulären Proteintransports aufzuklären, indem eine pathologische Störung als Modell verwendet wurde.    

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Ritz, Valentina: Molekulare Grundlagen des defekten Transports eines Glycoproteins bei der Pathogenese der Congenitalen Saccharase-Isomaltase Defizienz (CSID). Hannover 2002. Tierärztliche Hochschule.

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