Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Beta-adrenerge Rezeptoren im equinen Fettgewebe und ihre Bedeutung im Hinblick auf das Hyperlipämie-Syndrom des Ponies

Wrage, Sabine

The aim of this study was to determine the catecholamines-receptors (beta-adrenergic receptors, ß-AR) in the equine adipose tissue. It was of interest, whether there are differences between horse and pony relating to receptor subtypes and maximal numbers of binding sites. The catecholamines noradrenaline and adrenaline activate the ß-adrenergic receptors and stimulate lipolysis. Highly increased lipolysis is seen especially in case of hyperlipemia syndrome. Previous studies showed, that noradrenaline stimulation of isolated adipocytes of ponies revealed in an increased rate of lipolysis by higher activity of the triglycerid-cleaving hormone-sensitive-lipase (HSL), which is in contrast to adipocytes of horses. ß-adrenergic receptors (ß1+2+3) regulate the HSL by a second-messenger-system. The present study investigates ß-AR because there are no dates referring to the number and subtypes of ß-AR so far. Primary, the development of a method to separate the ß-AR from the equine adipose tissue was necessary. Therefore, abdominal cavity adipose tissue samples were taken immediately after evisceration of the animals. The plasma membrane of the adipocytes, which contains the receptor as a membrane-bound protein molecule, was isolated. Determination of marker enzymes verified the quality of preparation. The receptor binding studies were carried out according to studies of ß-AR in ileum muscle of the horse. At first, saturation binding assays of each receptor subtype have been performed (n=3 animals in each group) and then the maximal numbers of binding sites have been determined at a constant breakpoint in the saturation level (n=6 animals in each group). The use of two different concentration ranges of the radioligand 3H-CGP20177A (low: 0,06-3nM and high: 0,6-10nM) allows differentiation of the receptor subtypes ß3 and ß1+2. The proportions of ß1- and ß2-subtypes were determined by using non-radioactive high selective ligands in the low concentration range. Nonspecific binding was defined in parallel incubationsets by addition of propranolol and was subtracted from the total binding. The dissociation equilibrium constant (KD) of the binding curves shows high individual variability. Because of the small number of animals in each group (n=3) no report could be given for species-specific differences between the two groups. Further studies of more animals are necessary. The maximal number of binding sites from the ß-AR (Bmax) of adipocytes plasma membrane is significant lower in the pony group (Median 83,3 (46,8-199,9) fmol/mg protein as in the horse group (Median 299,5 (189,2-432,8) fmol/mg protein). The receptor subtype ß1 was not detectable in any animal. The proportion of ß3: ß2 was similar in both groups. The subtype ß3 dominates with 61% (± 1,4%) in the horses and with 70% (± 10,6%) in the ponies. The determination of the plain value from 100 adipocytes shows also significant differences between the two groups. The ponies have higher area values (Median 11,6 (3,6-18,4)mm²/100 Adipocytes) than the horses (Median 3,9 (1,4-5,0)mm²/100 Adipocytes), but it must be considered that in the pony-group more animals showed a very good body condition. In contrast to the horses a lower positive correlation between the body condition and the adipocyte cell size exist in the ponies. A negative correlation could be detected between the adipocyte cell size and the quantity of ß-AR. Because of this results the ß-AR are probably not the reason for the development of hyperlipemia. To interpret the lower receptor binding sites more studies about the binding affinities and the catecholamine levels in horses and ponies are required. The question about the increased rate of lipolysis could not be answered by this study.  

Ziel dieser Studie war es, die Catecholaminrezeptoren (ß-adrenerge Rezeptoren, ß-AR) des Fettgewebes bei Equiden und etwaige rassespezifische Unterschiede bezüglich des Rezeptorsubtypenbesatzes sowie der maximalen Gesamtbindungs-stellenanzahl zwischen Ponies und Großpferden zu ermitteln. Über eine Aktivierung der ß-adrenergen Rezeptoren stimulieren die Catechol-amine Noradrenalin und Adrenalin die Lipolyse, die bei dem equinen Hyperlipämie-Syndrom in gesteigertem Maße abläuft. Isolierte Ponyadipocyten zeigten in früheren Studien bei einer Inkubation mit Noradrenalin im Gegensatz zu Großpferdadipocyten eine erhöhte Lipolyserate durch eine gesteigerte Aktivität der triglyceridspaltenden Hormon-Sensitiven-Lipase. Dieses Enzym wird über ein Second-Messenger-System von den ß-adrenergen Rezeptoren (ß1+2+3) reguliert. Da über den Rezeptorbesatz bislang keine Daten vorliegen, sollten diese in vorliegender Arbeit ermittelt werden. Die Voraussetzung dazu war die Adaptation einer Methode zur Gewinnung der ß-adrenergen Rezeptoren aus dem equinen Fettgewebe. Es wurden Fettgewebsproben aus der Bauchhöhle von ausgeweideten Schlachttieren gewonnen und aus dem Gewebe die Adipocytenplasmamembran isoliert, die den Rezeptor als membrangebundenes Proteinmolekül enthält. Die Reinheit der Plasmamembranaufarbeitung wurde durch die Bestimmung von Markerenzymen kontrolliert. Die Rezeptorbindungsstudien orientierten sich an Untersuchungen der ß-adrenergen Rezeptoren in der Muskulatur des equinen Ileums. Es wurden Sättigungskurven für die Rezeptorbindungskapazität der einzelnen Subtypen erstellt (n=3 in der Pferde- und Ponygruppe) und danach die maximale Anzahl an Rezeptorbindungsstellen durch Messung eines Punktes im Sättigungsbereich ermittelt (n=6 in der Pferde- und Ponygruppe). Die Differenzierung der Rezeptorsubtypen erfolgte zum einen durch die Verwendung zweier unterschiedlicher Konzentrationsbereiche (0,06-3nM und 0,6-10nM) des Radioliganden 3H-CGP20177A, wodurch eine Unterscheidung des Subtyps ß3 von den Subtypen ß1+2 ermöglicht wird und zum anderen durch den Einsatz hochselektiver nicht radioaktiver Liganden im niedrigen Konzentrationsbereich zur Unterscheidung der Subtypen ß1+2. Die unspezifische Bindung wurde durch den Zusatz von Propranolol bestimmt und bei der Berechnung von der gemessenen Gesamtbindung subtrahiert. Die Höhe der berechneten Gleichgewichtsdissoziationskonstanten (KD) in den Bindungskurven variiert individuell stark und aufgrund der geringen Gruppengröße (n=3) lässt sich keine Aussage über etwaige Gruppenunterschiede machen. Hierzu sind Messungen weiterer Tiere nötig. Die maximale Anzahl der Bindungsstellen der ß-adrenergen Rezeptoren (Bmax) pro mg Adipocytenmembranprotein ist bei den Ponies signifikant geringer (Median 83,3 (46,8-199,9) fmol/mg Protein) als bei den Pferden (Median 299,5 (189,2-432,8) fmol/mg Protein). Bei keinem Tier in dieser Studie konnte der Rezeptorsubtyp ß1 nachgewiesen werden. Das Subtypenverhältnis ß3: ß2 ist in beiden Gruppen ähnlich, der Subtyp ß3 dominiert bei den Pferden mit 61% (± 1,4%) und bei den Ponies mit 70% (± 10,6%). Eine Bestimmung der Fläche, die 100 Adipocyten einnehmen, zeigte ebenfalls einen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Gruppen. Der Flächenwert der Ponies ist größer (Median 11,6 (3,6-18,4) mm²/100 Adipocyten) als der Flächenwert der Pferde (Median 3,9 (1,4-5,0) mm²/100 Adipocyten), wobei zu berücksichtigen ist, dass in der Ponygruppe mehr Tiere einen adipösen Ernährungszustand aufwiesen. Im Gegensatz zu den Pferden existiert aber bei den Ponies eine geringere positive Korrelation zwischen dem Ernährungszustand und der Adipocytengröße. Eine negative Korrelation ergab sich zwischen der Adipocytengröße und dem ß-adrenergen Rezeptorbesatz. Die ß-adrenergen Rezeptoren scheinen aufgrund dieser Ergebnisse keine ursächliche Rolle bei der Entstehung der Hyperlipämie zu spielen, wobei weitere Untersuchungen hinsichtlich der Bindungsaffinitäten und des Catecholaminhaushaltes beider Gruppen nötig sind, um das Ergebnis der geringeren Rezeptorbindungsstellenanzahl zu interpretieren. Die Frage nach der erhöhten Lipolyserate konnte durch diese Untersuchungen nicht beantwortet werden.  

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Wrage, Sabine: Beta-adrenerge Rezeptoren im equinen Fettgewebe und ihre Bedeutung im Hinblick auf das Hyperlipämie-Syndrom des Ponies. Hannover 2002. Tierärztliche Hochschule.

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