Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Einfluss verschiedener Sekretagoga auf die Insulinfreisetzung

Brenner, Martin

Recently some imidazoline compounds have been shown to exhibit Glucagon-like peptide-1 (GLP‑1) like, i.e. glucose-dependent effects. The sulfonylureas, that are currently used to treat diabetes lack this characteristic and therefore comprise the risk of hypoglycaemia.   The objective of the present thesis was to examine the effects of tolbutamide, GLP-1 and the imidazoline compound LY 374284 on the kinetics of insulin secretion. The MIN6-pseudoislets, consisting only of b-cells and pancreatic islets from diabetic db/db mice were used for secretion studies. The kinetics of insulin secretion were measured using a self-made 12-channel perifusion system with an improved temperature control.   MIN6-cells, cultured in suspension culture dishes, formed three-dimensional cell clusters within a few days. These MIN6-pseudoislets showed an almost identical secretion pattern compared to islets of Langerhans. Rising the temperature from 37°C to 38°C nearly tripled the insulin secretion, clearly indicating the importance of a precise temperature control. Tolbutamide, GLP-1 and LY 374284 caused a dose-dependent rise in insulin release from MIN6-pseudoislets. Furthermore GLP-1 and LY 374284 were active only at stimulatory glucose concentrations.   No significant differences in insulin secretion between islets from 13 week old diabetic animals and control animals could be demonstrated. At the age of 15 weeks however, there was a marked decrease in insulin release, that further diminished with increasing age and mainly impaired the first phase. Insulin secretion was shown to be potentiated dose-dependently by GLP-1 and LY 374284 only at stimulatory glucose concentrations. In contrast, tolbutamide showed a significant glucose-independent insulin release. Finally, GLP-1 and LY 374284 restored the physiologic biphasic insulin secretion pattern in db/db islets. The first phase of insulin secretion was restored to 81% by GLP-1 (30nM) and to almost 70% by LY 374284 (10mM). Both compounds caused a second phase that exceeded the control by more than 50%. Tolbutamide completely failed to restore the secretion profile.   Imidazolines are potential new compounds for the treatment of diabetes mellitus. Because of their strictly glucose-dependent effects, they could replace the currently used sulfonylureas. The imidazoline compound LY 374284 restored glucose-dependently the insulin secretion pattern in pancreatic islets of db/db mice. This rodent model for type 2 diabetes mellitus is well suited to test new compounds because it bears resemblance to the human type of diabetes. Compared with that, the MIN6-pseudoislets could turn out to be a useful model to study the fundamental steps in insulin secretion. Interestingly, even after 30 years, perifusion remains the state of the art method to examine the kinetics of insulin secretion.  

In letzter Zeit konnte für einige Vertreter der Imidazoline eine Glucagon-like peptide-1 (GLP‑1) ähnliche und somit glukoseabhängige Wirkung auf die Insulinsekretion gezeigt werden. Diese Eigenschaft besitzen die gegenwärtig zur Therapie des Diabetes mellitus verwendeten Sulfonylharnstoffe nicht, weshalb ihr Einsatz mit dem Risiko einer Hypoglykämie behaftet ist.   In der vorliegenden Arbeit sollte die Wirkung von Tolbutamid, GLP-1 und dem Imidazolin LY 374284 auf die Insulinfreisetzungskinetik in vitro untersucht werden. Die Substanzen wurden an MIN6-Pseudoinseln, einem ausschließlich aus b-Zellen bestehenden Sekretionsmodell und an Langerhansschen Inseln von db/db-Mäusen, einem Modell für Typ 2 Diabetes mellitus getestet. Zur Erfassung der Insulinfreisetzungskinetik wurde ein 12-Kanal-Perifusionssystem mit verbesserter Temperatursteuerung aufgebaut.   In Suspensionskultur gehaltene MIN6-Zellen entwickelten sich innerhalb weniger Tage zu nichtadhärenten dreidimensionalen Zellverbänden, die ein biphasisches Sekretionsprofil aufwiesen, das mit dem der Langerhansschen Inseln nahezu identisch war. Die Insulinfreisetzung aus MIN6-Pseudoinseln wurde bei einer geringen Temperaturerhöhung von 1°C um nahezu das Dreifache gesteigert, wodurch die Relevanz einer exakten Temperaturkontrolle unterstrichen wird. Tolbutamid, GLP-1 und das Imidazolin LY 374284 riefen eine dosisabhängige Insulinfreisetzung hervor. Für GLP-1 und LY 374284 konnte zudem eine glukoseabhängige Wirkung gezeigt werden.   Die Untersuchung des sich entwickelnden Insulinsekretionsdefektes bei db/db-Mäusen zeigte, dass bei Langerhansschen Inseln von 13 Wochen alten Tieren keine signifikante Veränderung im Sekretionsprofil gegenüber Kontrollinseln auftrat. Ab einem Alter von 15 Wochen dagegen wurde eine stark reduzierte Insulinfreisetzung festgestellt, die bis zum Alter von 20 Wochen weiter abnahm und vor allem die akute Phase der Insulinsekretion betraf. Im Gegensatz zu Tolbutamid konnte die Insulinsekretion bei den diabetischen Inseln durch GLP-1 und LY 374284 konzentrationsabhängig und ausschlie"slich in einer stimulatorischen Glukoseumgebung gesteigert werden. Abschlie"send konnte dargestellt werden, dass GLP-1 und LY 374284 in der Lage sind, das physiologische Sekretionsprofil bei db/db-Inseln wieder herzustellen. Hierbei wurde die Phase 1 durch GLP-1 (30nM) zu 81% und durch LY 374284 (10mM) zu fast 70% im Vergleich zur Kontrolle wieder hergestellt. Die zweite Phase konnte durch beide Substanzen sogar um mehr als 50% gegenüber der Kontrolle erhöht werden.   Imidazoline besitzen aufgrund ihrer GLP-1-ähnlichen Wirkung das Potenzial, die etablierte Therapie des Diabetes mellitus mit Sulfonylharnstoffen nicht nur zu ersetzen, sondern auch das Spektrum der unerwünschten Wirkungen um das Risiko einer Hypoglykämie zu reduzieren. Das Imidazolin LY 374284 konnte bei Langerhansschen Inseln von db/db-Mäusen das physiologische Sekretionsprofil wieder herstellen. Dieses Tiermodell weist zahlreiche Parallelen zum humanen Typ 2 Diabetes mellitus auf und eignet sich daher gut zur Untersuchung neuer Substanzen. MIN6-Pseudoinseln könnten sich dagegen als wichtiges Sekretionsmodell zur Erforschung der grundlegenden Vorgänge der Insulinfreisetzung erweisen. Für die Darstellung der Insulinsekretion, vor allem aber der Insulinfreisetzungskinetik bleibt die Perifusion auch nach 30 Jahren das Mittel der Wahl.  

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Brenner, Martin: Einfluss verschiedener Sekretagoga auf die Insulinfreisetzung. Hannover 2002. Tierärztliche Hochschule.

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