Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Immunreaktionen in der Darmwand und Darmlymphe nach Gabe bakterieller Antigene in das Darmlumen

Hoffmann-Moujahid, Astrid

The uptake of antigen in the gut-associated lymphoid tissue (GALT) through the gut wall can result in a humoral or cell-mediated immune response or lead to the development of oral tolerance. Although the oral application of vaccines is gaining acceptance, the various mechanisms behind immune reactions are not fully understood yet. Thus, new findings about immune reactions in the gut wall and gut lymph after the administration of antigen in the gut lumen are of great interest. In this study the intestinal lymph duct was cannulated in Göttingen miniature pigs, 3 month after all mesenteric lymph nodes had been resected. The afferent gut lymph was collected over a period of 7.2 ± 1.4 days. The lymph flow and the number of lymphocytes and other nuclear cells (neutrophilic and eosinophilic granulocytes and dendritic cells) were determined at intervals of about 12 hours. Following a period of 3.5 ± 0.89 days after cannulation of the intestinal lymph duct, the animals were orally immunized with cholera toxin (CT). Lymph and blood samples were collected simultaneously and examined for the total number of antibody secreting cells and cholera toxin-specific (CT-specific) antibody secreting cells, before and after immunisation, using the ELISPOT method. In addition, the number of IL-2, IL-4 and TGF-b mRNA positive cells were determined on cytospin preparations of lymph samples, before and after immunisation, using in situ hybridization. In 3 of 5 animals a increase of lymph flow was observed 1 to 2 days after immunisation. The lymph flow of all animals was 21.1 ± 3.5 ml/h and thus higher than the lymph flow in preceding studies where no immunisation of the animals had taken place. A trend of increase in the flow of lymphocytes was also observed in all examined animals 1 to 2 days after immunisation for 12 to 48 hours. In 3 of the 5 animals the flow of other nuclear cells tend to increased after immunisation, however, it was not as pronounced. The investigation of blood samples by the ELISPOT method first showed CT-specific antibody secreting cells between day 2 and day 5 after immunisation. Thus, an emigration of activated B cells from the gut wall even more rapid than described in previous studies should be taken into consideration, at least in pigs. Furthermore, the lack of IgM+ cells after more than 3 days after immunisation confirmed the isotype switch of IgM+ cells. After the uptake of bactirial antigen CT-specific antibody secreting cells were observed in the lymph almost exclusively on day 3 after immunisation. The intestinal lamina propria already showed an accumulation of CT-specific antibody secreting cells, with a dominance of the IgA isotype, after 4 and 5 days after immunisation. The presence of IL-2, IL-4 and TGF-b mRNA positive cells was proved in cytospin preparations of lymph samples before and after immunisation. Through this study further knowledge was acquired regarding immune reactions in the gut wall and the participating immune cells and cytokines. Immune reactions initiated by the administration of bacterial antigen into the gut lumen have been proved in the gut wall and gut lymph. Furthermore, various changes of the cells emigrating from the gut wall were demonstrated. The information gained through this study lays the foundation for future research regarding the effect of oral administration of antigens on various lymphocyte subsets and supports the development of other cytokine profiles in the gut lymph.  

Die Aufnahme von Antigen in das darmassoziierte lymphatische Gewebe durch die Darmwand kann eine humorale oder zelluläre Immunreaktion auslösen oder zur Ausbildung oraler Toleranz führen. Da die den verschiedenen Immunreaktionen zugrundeliegenden Mechanismen noch nicht verstanden sind, die orale Gabe von Impfstoffen aber zunehmende Bedeutung gewinnt, sind weitere Erkenntnisse über Immunreaktionen in Darmwand und Darmlymphe nach Gabe bakterieller Antigene in das Darmlumen von großem Interesse. In dieser Arbeit wurde eine Kanülierung des Truncus lymphaticus intestinalis an Göttinger Miniaturschweine durchgeführt, nachdem 3 Monate zuvor eine Resektion der mesenterialen Lymphknoten erfolgt war. Die so gewonnene afferente Darmlymphe wurde über einen Zeitraum von durchschnittlich 7,2 ± 1,4 Tage gesammelt und in Intervallen von ca. 12 h der Lymphfluss und die Anzahl an Lymphozyten und anderen nukleären Zellen (neutrophile und eosinophile Granulozyten und dendritische Zellen) bestimmt. Durchschnittlich 3,5 ± 0,89 Tage nach der Kanülierung des Truncus lymphaticus intestinalis wurden die Tiere oral mit Choleratoxin (CT) immunisiert und Lymphproben, sowie parallel gewonnene Blutproben, vor und nach Immunisierung mittels ELISPOT-Technik auf die Gesamtzahl an antikörper-sezernierende Zellen und CT-spezifische antikörper-sezernierende Zellen untersucht. Außerdem wurde in Zytopräparaten von Lymphproben vor und nach Immunisierung mittels in-situ-Hybridisierung die Anzahl an IL-2, IL-4 und TGF-b mRNA positiven Zellen bestimmt. Bei 3 von 5 Tieren konnte 1 bis 2 Tage nach Immunisierung ein Anstieg des Lymphflusses beobachtet werden. Der mittlere Lymphfluss aller Tiere lag mit 21,1 ± 3,5 ml/h im Schnitt über den in vorhergehenden Arbeiten beschriebenen Lymphflüssen, bei denen keine Immunisierung der Tiere erfolgt war (Rothkötter et al. 1993, 1995). Auch der Lymphozytenfluss zeigte bei 4 von 5 Tieren 1 bis 2 Tage nach Immunisierung für 12 bis 48 h einen tendenziellen Anstieg. Bei 3 der 5 Tiere kam es nach Immunisierung zu einer tendenziellen Zunahme des Flusses an anderen nukleären Zellen, der aber weniger deutlich ausgeprägt war. Bei der Untersuchung von Blutproben mittels ELISPOT-Technik traten CT-spezifische antikörper-sezernierende Zellen erstmals zwischen Tag 2 und Tag 5 nach Immunisierung auf, so dass, zumindest für die Spezies Schwein, eine noch schnelleren Auswanderung aktivierter B-Zellen aus der Darmwand als in der Literatur bisher beschrieben in Erwägung zu ziehen ist. Außerdem bestätigte das Fehlen IgM+ Zellen nach mehr als 3 Tagen nach Immunisierung erneut den Isotypen-Switch der IgM+ Zellen. Nach Antigen-Gabe konnten in der Lymphe CT-spezifische antikörper-sezernierende Zellen fast ausschließlich am dritten Tag nach Immunisierung nachgewiesen werden. In der intestinalen Lamina propria kam es bereits 4 und 5 Tage nach Immunisierung zur Akkumulation CT-spezifischer antikörper-sezernierender Zellen bei Dominanz des IgA-Isotyps. In den Zytopräparaten von Lymphproben vor und nach Immunisierung konnten IL-2, IL-4 und TGF-b mRNA positive Zellen nachgewiesen werden. Durch die vorliegende Arbeit konnten weitere Erkenntnisse über Immunreaktionen in der Darmwand und den daran beteiligten Immunzellen und Zytokinen gewonnen werden. Nach der Gabe bakterieller Antigene in das Darmlumen wurden ausgelöste Immunreaktionen in Darmwand und Darmlymphe nachgewiesen und mehrfach Veränderungen der aus der Darmwand auswandernden Zellen aufgezeigt. In dieser Arbeit gewonnene Erkenntnisse bilden die Grundlage für zukünftige Untersuchungen zum Einfluss der oralen Gabe von Antigenen auf verschiedene Lymphozyten-Subpopulationen und zur Erstellung weiterer Zytokinprofile in der Darmlymphe.  

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Hoffmann-Moujahid, Astrid: Immunreaktionen in der Darmwand und Darmlymphe nach Gabe bakterieller Antigene in das Darmlumen. Hannover 2002. Tierärztliche Hochschule.

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