Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Immunisierungsversuche mit rekombinantem Major Sperm Protein von Dictyocaulus viviparus

Köhrmann, Annika

Dictyocaulosis is still one of the most important parasitic diseases in cattle on pasture. A recombinant protein and two DNA fragments based on the antigen Dv3-14 were used in immunisation trials and tested for their immunogenic and protective potential.   The recombinant protein Dv 3-14 was cloned into a procaryotic plasmid vector (pQE-31, QIAGEN), the recombinant major sperm protein was expressed in E. coli and purified. The immunisation of mice and cattle with this recombinant protein induced an antibody response after 14 days. Vaccination of mice with plasmid DNA (pCRâ3.1, INVITROGEN and pDual®, STRATAGENE) induced no seroconversion. The calves immunised with the recombinant antigen were challenged by experimental infection with 3.000 L3-larvae of D. viviparus. In the immunised group the number of excreted larvae was significantly reduced to 64.47 % (p = 0.03) in comparison to the control animals. After necropsy adult worms were recovered by lung perfusions. Adult worms were counted and measured. The worm burden was 71.13 % lower in the immunised animals, however, this result was statistically not significant. The length of worms showed a mean reduction of 39,8 % (p = <0.001) in the immunized group. The data show that the recombinant antigen was able to stimulate a significant immunological reaction against infections with D. viviparus in cattle, however failed to show a satisfactory protective potential.   In comparison with other MSP of nematodes the aminoacid sequence of the MSP from D. viviparus varies extremely at its carboxy-terminal end. Serum of a D. arnfieldi infected donkey showed no crossreaction with the recombinant MSP from D. viviparus in the immunoblot.   Expression in pQE-31 provided high yields of purified recombinant Dv3-14, thus improving the serodiagnostic of D. viviparus infections by immunoblot. The nitocellulose strips loaded with the recombinant protein expressed in E. coli were stored at 4 °C and -20 °C up to 6 months without any loss of sensitivity of the blots.  

Die Dictyocaulose gehört auch heute noch zu den bedeutendsten Helminthosen der Weiderinder. Auf Grundlage des Antigens Dv3-14 wurden ein rekombinantes Protein und zwei Plasmid-DNA Genfragmente konstruiert und in Immunisierungsversuchen auf ihr immunstimulatorisches und protektives Potential getestet.   Das rekombinante Antigen Dv3-14 wurde in ein prokaryotisches Vektorsystem (pQE-31, QIAGEN) kloniert, das rekombinante MSP in E. coli exprimiert und aufgereinigt. Die Immunisierung von Mäusen und Rindern mit diesem rekombinanten Protein rief bereits nach 14 Tagen eine Immunantwort hervor. Die Vakzinierung von Mäusen mit Plasmid-DNA (pCRâ3.1, INVITROGEN und pDual®, STRATAGENE) rief keine Serokonversion hervor. Die Rindergruppe, die mit dem rekombinanten Protein immunisiert wurde, erhielt eine Challenge-Infektion mit 3.000 L3-Larven von D. viviparus. Die Anzahl der ausgeschiedenen Larven war in der immunisierten Gruppe gegenüber der Kontrollgruppe um 64,47 % reduziert (p = 0,03). Nach der Tötung wurden die in der Rinderlunge enthaltenen Würmer ausgespült, gezählt und vermessen. Die Wurmbürde war in der immunisierten Gruppe um 71,13 % niedriger. Dieses Ergebnis konnte statistisch nicht abgesichert werden. Die durchschnittliche Länge der Würmer war in der immunisierten Versuchsgruppe um 39,8 % reduziert (p = <0,001). Diese Daten bestätigen den immunstimulatorischen Charakter des Antigens gegen D. viviparus. Ein zufriedenstellender Nachweis des protektiven Potentials ist hingegen nicht gelungen.    Ein Sequenzidentitätenvergleich mit anderen bekannten MSP von Nematoden ergab, dass sich die Aminosäuresequenz des D. viviparus-MSP von anderen Sequenzen Carboxy-terminal sehr stark unterscheidet. Im Immunoblot wurde keine Kreuzreaktion des rekombinanten MSP von D. viviparus mit Serum eines D. arnfieldi-infizierten Esels beobachtet.   Durch die hohe Expressionsrate an reinem rekombinantem Dv3-14 Protein in pQE-31 konnte der Nachweis von D. viviparus-Infektionen mit dem Immunoblot vereinfacht werden. Die mit rekombinantem E. coli-Protein beladenen Nitrocellulosestreifen wurden ohne Sensitivitätsverlust bis zu 6 Monaten bei 4 °C und -20 °C aufbewahrt.  

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Köhrmann, Annika: Immunisierungsversuche mit rekombinantem Major Sperm Protein von Dictyocaulus viviparus. Hannover 2002. Tierärztliche Hochschule.

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