Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Parallele Identifizierung des Genus Mycobacterium und des M. tuberculosis-Komplexes bzw. M. avium am Lightcycler

Lachnik, Jacqueline

The increased occurence of non-tuberculous mycobacteria in medicine asks for further diagnostic methods because most assays only allow the detection of single species. So far, there is no standardized molecular biological method to detect mycobacteria. The Lightcycler PCR system performs an amplification followed by DNA:DNA hybridization in less than one hour. It is possible to detect mycobacteria and differentiate the clinically most relevant species, M. tuberculosis complex and M. avium from other nontuberculous mycobacteria simultaneously. Targeting a 1000 bp fragment of the 16S rRNA gene, FRET-probes were contructed for two various genus specific regions. A M. tuberculosis complex specific as well as a M. avium specific probe, which both bind to the hypervariable region of the gene, were also designed. The amplification itself did not show 100 % specificity. Besides mycobacterial DNA, the DNA of corynebacteria was coamplified. By using FRET probes, however, the specificity could be increased. All of 33 tested mycobacteria can be unambigiously differentiated from non-mycobacterial organisms, including closely related actinomycetes. Aligned 16S rRNA gene sequences of over 100 various mycobacteria illustrate the high homogeneity of the newly introduced genus region III. A 100 % specificity was also demonstrated for the M. tuberculosis complex specific probe and the M. avium specific probe. As few as five genomic copies of target nulceic acid were detected by all probes. Even in background-DNA as high as 107 nontuberculous genomic copies and additional 50 plasmid copies of the constructed inhibition control, 10 genomic copies were detected. All reactions are performed in a closed tube format and post-PCR manipulations are not needed. The Lightcycler-PCR system is a rapid alternative to work intensive, conventional PCR and Southern blotting. At present, this system is the fastest available method for identification and differentiation of mycobacteria from culture-positive specimens. In the future, it can be tested with clinical isolates.  

Das immer häufigere Vorkommen von nicht-tuberkulösen Mykobakterien in der Klinik bedarf einer Ausweitung der Diagnostik auf diesem Gebiet, da die meisten Assays nur die Detektion einzelner Spezies zu lassen. Ein Diagnostik-Standard für Mykobakterien auf molekularbiologischer Ebene fehlt bislang. Mit dem Lightcycler-PCR-System, das eine Amplifikationsreaktion mit anschließender Sondenhybridisierung in weniger als 1 h durchführt, ist es möglich, das Genus Mycobacterium und zeitgleich die klinisch häufigsten Spezies, den M. tuberculosis-Komplex bzw. M. avium, zu detektieren und dabei von anderen Mykobakterien zu differenzieren. Als Zielsequenz wird hierfür ein 1000 bp großes Fragment des 16S rRNA-Gens genutzt. Konstruiert wurden FRET-Sonden für zwei verschiedene, genusspezifische Bereiche sowie eine M. tuberculosis-Komplex- und eine M. avium -spezifische Sonde, die im hypervariablen Bereich an die DNA binden. Die Amplifikationsreaktion allein ist nicht 100% genusspezifisch. Neben Mykobakterien werden auch Corynebakterien nachgewiesen. Durch den Einsatz von FRET-Sonden wird die Spezifität jedoch erhöht. Alle 33 getesten Mykobakterien können durch die Sondenhybridisierung eindeutig von nicht-mykobakteriellen Keimen, einschließlich verwandten Aktinomyzeten, differenziert werden. Ein Sequenzvergleich mit insgesamt über 100 verschiedenen Mykobakterienspezies zeigt, dass der in dieser Arbeit neu vorgestellte Genusbereich III eine hohe Homologie aufweist. Auch die M. tuberculosis-Komplex-spezifische wie auch die M. avium–spezifische Sonde zeigten 100% Spezifität. Durch die Überprüfung der Sensitivität aller Sonden wurde ersichtlich, dass fünf Genome pro PCR-Reaktion zuverlässig detektierbar sind. Selbst in einem bakteriellen Hintergrund von 107 Organismen und bei gleichzeitigem Einsatz von 50 Kopien der in dieser Arbeit konstruierten Inhibitionskontrolle ist die Detektion von 10 Genomen möglich. Sämtliche Reaktionen finden in einer geschlossenen Kapillare statt und bedürfen keiner post-PCR-Manipulation. Durch das Lightcycler PCR-Real Time System kann der Arbeitsaufwand für PCR und Southernblotanalyse stark reduziert werden. Es stellt zur Zeit die schnellste Methode zur Identifikation und Differenzierung von Mykobakterien aus kulturpositiven Proben dar und kann zukünftig im Rahmen einer klinischen Studie an Proben aus Patientenmaterial getestet werden.  

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Lachnik, Jacqueline: Parallele Identifizierung des Genus Mycobacterium und des M. tuberculosis-Komplexes bzw. M. avium am Lightcycler. Hannover 2002. Tierärztliche Hochschule.

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