Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zur genetischen Disposition für die Helicobacter pylori-Infektion im Mausmodell

Meffert, Nina

In the present study, we aimed to verify the HpSS1 mouse model established at the Institute of Laboratory Animal Science, Hanover Medical School, in 2000. In addition, two other vacA-/cagA-positive H. pylori strains, Hp87 and Hp89, were chosen to establish a new mouse model. A total of 240 mice of the inbred strains C3H/HeJ, C57BL/6J and FVB/N were inoculated intragastrically with HpSS1 (n = 60), Hp87 (n =. 60), Hp89 (n = 60) and necropsied after 3 or 6 months of infection. 60 controls were challenged with sterile phosphate buffered saline (PBS) and also necropsied after 3 or 6 months post inoculation. As another part of the study, the roles of several gene products (Fas, TNF-R1, RAG-1, ICAM-1 and IL-10) in H. pylori pathogenesis were examined. A total of 135 mice of the mutant strains B10.BR-Faslpr, B6.129-Tnfrsf1atm1Mak, B6.129S7-Rag1tm1Mom, B6.129S7-Icam1tm1Bay und B6.129P2-Il10tm1Cgn and their background strains C57BL/6J and B10.BR were necropsied 3 months after inoculation with HpSS1 or PBS. For H. pylori detection, the stomach tissue was used for bacterial culture and histologic evaluation of the intensity of gastric inflammation and the level of H. pylori-colonization (stained with hematoxylin and eosin reagents (H.-E.) and Warthin-Starry reagents). Additionally, caeca and colons of the Il10tm1Cgn-mice were histologically examined (H.-E. staining) concerning inflammation levels and other pathohistologic changes Bacterial culture was positive for H. pylori in 38 (15.6%) of 244 H. pylori-inoculated mice of all strains (26% HpSS1; 6.8% Hp87 and 1.7% Hp89), whereby HpSS1 and Hp87 could be reisolated most frequently from C3H/HeJ-mice. These isolates were examined for vacA (middle region) by H. pylori-specific PCR, indicating that they originated from the inoculated strains HpSS1, Hp87, and Hp89, respectively (sensitivity: 71%; specificity: 100%). None of the 122 controls was tested positive for H. pylori in bacterial culture. Further, an EIA was performed to identify H. pylori antigen from feces (sensitivity: 11.5%; specificity: 100%). Bacteria resembling H. pylori were detected histologically in 105 (43%) of 244 H. pylori-inoculated mice (40% HpSS1, 52.5% Hp87 and 37.9% Hp89). None of the controls showed H. pylori colonization. The bacteria were found next to the gastric epithelium, located in the mucus and in the upper third of the gastric pits. Bacterial density of all H. pylori-isolates decreased with time in all gastric regions, but did not reach statistic significance. C57BL/6J mice had significantly higher colonization levels by each H. pylori-isolate after 3 months of infection than FVB/N mice. Comparing the ability to colonize the gastric mucosa, there were no significant differences among the three H. pylori isolates. In 239 (98%) of 244 H. pylori-inoculated mice and in 114 (93.4%) of 122 controls, leukocytic infiltrates were found in the gastric mucosa (HpSS1: 97.6%, Hp87 and Hp89: 98.3%). The intensity of gastric inflammation decreased significantly with time in some histological parameters among the inbred strains of mice inoculated with HpSS1 and Hp87. Mice inoculated with HpSS1 had the highest leukocytic infiltration rates, however this finding did not reach statistical significance. HpSS1-inoculated C57BL/6J and C3H/HeJ mice showed the highest intensity and activity of gastric leukocytic infiltration at each time of infection, whereas the FVB/N strain showed the lowest intensity of inflammation. These findings did not reach statistical significance, either. Strain differences could not be found comparing the levels of leukocytic infiltration in the HpSS1-inoculated mutant mice with the HpSS1-inoculated wildtype mice, but in levels of HpSS1-colonization and activity of gastritis. In general, the HpSS1-inoculated mutant mice showed higher colonization levels compared to the HpSS1-inoculated wildtype mice (B6.129S7-Rag1tm1Momversus C57BL/6J: body and antrum p < 0.05; B6129-Tnfrsf1atm1Makversus C57BL/6J: body p < 0.05). The infiltration with polymorphnuclear leukocytes in the gastric mucosa was higher in some mutant mouse strains versus the background strains (B6.129S7-Rag1tm1Mom versus C57BL/6J: antrum p < 0.05; B6.129-Tnfrsf1atm1Mak versus C57BL/6J: cardia p < 0.05; B10.BR.-Faslpr versus B10.BR: body p < 0.05). Histologic examination of the caeca and colons of the Il10tm1Cgn mice, a modelsystem for inflammatory bowel disease (IBD), implicated a supressing effect of H. pylori on the development of inflammation in the caecum. Here, the controls showed a significantly higher intensity of inflammation (p < 0.05) of the caecal mucosa than the HpSS1-inoculated mice. Other histopathological findings in the gastric mucosa such as erosion/ulceration, atrophy/hyperplasia, intestinal metaplasia or adenocarcinoma were not observed. The formation of lymphoid cell aggregates in the gastric mucosa was observed in 15% of the HpSS1-inoculated C3H/HeJ mice and in 20% of the HpSS1-inoculated Il10tm1Cgn  mice. In conclusion, the HpSS1 mouse model was only useful to describe genetic strain differences in colonization levels of the gastric mucosa among inbred strains of mice. Moreover, HpSS1 could help to identify the role of certain host genes in H. pylori pathogenesis by using genetically altered mice. In view of the mild histopathological changes and fairly low colonization levels (especially Hp89), Hp87 and Hp89 could not convince as a new mouse model of H. pylori-infection.  

In den vorliegenden Untersuchungen sollte das von JANKE (2000) am Zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover etablierte H. pylori Stamm Sydney (HpSS1)-Mausmodell verifiziert werden und ein neues Mausmodell unter Verwendung von zwei H. pylori-Isolaten (Hp87 und Hp89) mit hochgradiger Human-pathogenität etabliert werden. Dazu wurden 180 Mäuse der Inzuchtstämme C3H/HeJ, C57BL/6J und FVB/N mit den H. pylori-Isolaten HpSS1 (n = 60), Hp87 (n = 60), Hp89 (n = 60) für einen Beobachtungszeitraum von 3 bzw. 6 Monaten experi-mentell intragastral infiziert. Sechzig Kontrolltiere erhielten steriles PBS. Ferner wurden 135 Mäuse ausgewählter Defektmutantenstämme (B10.BR-Faslpr, B6.129-Tnfrsf1atm1Mak, B6.129S7-Rag1tm1Mom, B6.129S7-Icam1tm1Bay und B6.129P2-Il10tm1Cgn) und deren Hintergrundstämme (C57BL/6J und B10.BR) mit HpSS1 bzw. PBS inokuliert, um den Einfluss der bei den Mutanten fehlenden Genprodukte (Fas, TNF-R1, RAG-1, ICAM-1 und IL-10) auf das H. pylori-Infektionsgeschehen (Entzündungs- und Kolonisationsgrad der Magenschleimhaut) zu überprüfen. Der Beobachtungszeitraum lag bei 3 Monaten. Zum H. pylori-Nachweis wurden die Magenhälften kulturell (Dent-Nährboden mit Bacitracin) und histologisch (H.E.- und Warthin-Starry-Färbung) untersucht. Zusätzlich wurden Zäkum und Kolon der Il10tm1Cgn-Mäuse auf pathohistologische Veränderungen (H.E.-Färbung) untersucht. Kulturell konnte bei 38 (15,6%) von 244 H. pylori-inokulierten Mäusen eine H. pylori-Infektion nachgewiesen werden (HpSS1: 26%, Hp87: 6,8% und Hp89: 1,7%), wobei HpSS1 zusammen mit Hp87 am häufigsten bei den C3H/HeJ-Mäusen (HpSS1: 50%; Hp87: 15%) nachgewiesen wurden. Bei keiner der 122 Kontrollmäuse konnte eine H. pylori-Infektion kulturell nachgewiesen werden. Mit Hilfe einer PCR zum Nachweis der Mittelregion des vacA-Gens von H. pylori wurde gezeigt, dass es sich bei den Reisolaten um den applizierten HpSS1, Hp87 bzw. Hp89 handelte. Die Sensitivität der PCR betrug 71% bei 100%-iger Spezifität. Als weiteres Nachweisverfahren diente ein H. pylori-spezifischer EIA zum Nachweis von H. pylori-Antigen aus dem Kot. Dieser wies jedoch nur eine geringe Sensitivität (11,5%) bei 100%-iger Spezifität auf. Histologisch (Warthin-Starry) wurde bei 105 (43%) von 244 H. pylori-inokulierten Mäusen eine H. pylori-Infektion nachgewiesen (HpSS1: 40,9%, Hp87: 52,5% und Hp89: 37,9%). Auch mit dieser Nachweismethode konnte bei keiner Kontrollmaus eine H. pylori-Infektion nachgewiesen werden. Der Besiedlungsgrad aller H. pylori-Isolate nahm im zeitlichen Verlauf in jeder Schleimhautdrüsenregion ab, jedoch ohne statistische Signifikanz. Die Tiere des Stammes C57BL/6J wiesen nach 3 Monaten p.i. signifikant höhere Kolonisationsgrade pro Isolat als die FVB/N-Mäuse auf. Unterschiede in der Kolonisationsfähigkeit der eingesetzten H. pylori-Isolate HpSS1, Hp87 und Hp89 konnten nicht festgestellt werden. Im H.E.-Präparat konnten bei 239 (98%) der 244 H. pylori-inokulierten Mäuse und bei 114 (93,4%) der 122 Kontrollmäuse leukozytäre Infiltrationen der Magenschleimhaut nachgewiesen werden (HpSS1: 97,6%, Hp87: 98,3% und Hp89: 98,3%). Bei den HpSS1- und Hp89-inokulierten Inzuchtstämmen nahm der Entzündungsgrad der Magenschleimhaut bei einzelnen histologischen Parametern im zeitlichen Verlauf der Infektion signifikant ab. Trendbefunde wiesen darauf hin, dass eine Infektion mit HpSS1 den Entzündungsgrad der Magenschleimhaut bei den Inzuchtstämmen am stärksten beeinflusste. Bei den HpSS1-inokulierten Inzuchtstämmen wiesen C3H/HeJ und C57BL/6J die stärksten leukozytären Infiltrationen der Magen-schleimhaut nach beiden Beobachtungsdauern auf, jedoch ohne statistisch signifikante Unterschiede zu FVB/N. Beim Vergleich von Defektmutanten- und Hintergrundstämmen konnten keine stammesspezifischen Unterschiede im Grad der leukozytären Infiltrationen beobachtet werden. Im HpSS1-Kolonisationsgrad und im Aktivitätsgrad der leuko-zytären Infiltrationen ließen sich jedoch signifikante Unterschiede sichern. Die Defektmutanten wiesen im Allgemeinen höhere HpSS1-Kolonisationsraten als die Wildtypstämme auf (B6.129S7-Rag1tm1Momversus C57BL/6J: Fundus und Pylorus p < 0,05; B6.129-Tnfrsf1atm1Mak versus C57BL/6J: Fundus p < 0,05). Im Aktivitätsgrad der leukozytären Infiltrationen wiesen einige Defektmutanten ebenfalls höhere mittlere Werte als ihr jeweiliger Hintergrundstamm auf (B10.BR-Faslpr versus B10.BR: Fundusdrüsenregion p < 0,05; B6.129S7-Ragtm1Mom versus C57BL/6J: Pylorus: p < 0,05 und B6.127-Tnfrsf1atm1Makversus C57BL/6J: Kardia: p < 0,05). Die histologische Untersuchung des Dickdarmes IL-10-defizienter Mäuse, einem Modellsystem für chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED) wies auf eine dämpfende Wirkung von H. pylori auf das Entzündungsgeschehen im Zäkum hin, da dort bei den Kontrollmäusen ein schwach signifikant höherer Entzündungsgrad vorlag als bei den HpSS1-inokulierten Mäusen. Morphologische Veränderungen der Magenschleimhaut wie Erosionen/Ulzerationen, Hyperplasie/Atrophie oder Tumorbildung konnten durch keines der Mausmodelle induziert werden. Follikelähnliche Aggregationen wurden mit einer Häufigkeit von 15% bei den HpSS1-inokulierten C3H/HeJ-Mäusen und von 20%  bei den Il10tm1Cgn-Mäusen festgestellt. Zusammenfassend betrachtet eignete sich das HpSS1-Mausmodell hier nur zur Darstellung mausstammesspezifischer Unterschiede im Kolonisationsgrad. HpSS1 bot jedoch im Defektmutantenmodell gute Möglichkeiten zur Überprüfung der Rolle bestimmter Gene im H. pylori-Infektionsgeschehen (v.a. Aktivitätsgrad der leukozytären Infiltrationen und Kolonisationsgrad). Hp87 und Hp89 konnten im Mausmodell aufgrund der nur milden histopathologischen Veränderungen und relativ geringen Kolonisationsraten (v. a. Hp89) nicht überzeugen.  

Zitieren

Zitierform:

Meffert, Nina: Untersuchungen zur genetischen Disposition für die Helicobacter pylori-Infektion im Mausmodell. Hannover 2002. Tierärztliche Hochschule.

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export