Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Die Kohlenhydraterkennungsdomäne der Spermadhäsinfamilie

von, Bettina

Interactions between cells play an important role in mammalian fertilization. Sperm bind to the oviductual epithelium in the caudal isthmus and form there a sperm reservoir. Further sperm bind to zona pellucida of the oocyte, for penetrating it after acrosome reaction and in order to fertilize the oocyte. These essential steps of cell recognition are mediated by oligosaccharid structures on the epithelium and the zona pellucida and by carbohydrate binding proteins on the sperm. Spermadhesins, as sperm-associated proteins, have a special function in these cell interactions. They are proteins of low molecular weight with a CUB domain in their structure. They belong to a novel class of lectins, because they are able to bind to carbohydrates, but do not show any similarity with known lectins. In the present investigation the location of the carbohydrate recognition domain of the spermadhesins should be characterized. Using DNA recombination technics and site-directed mutagenesis, AQN-1 was expressed in E. coli in recombinant form and three mutated forms. Aminoacid glycin-54 in spermadhesinfrequence was substituted by the different aminoacids alanin, asparatic acid and serin. After purification of the native, recombinant and mutated form of AQN-1 an enzyme- linked lectin assay (ELLA) with a-D-mannose-PAA-biotin was performed. The dissociation constant (KD) was calculated by scatchard plot analysis from the binding curves. If the binding constant of the native form is compared with the constant of the recombinant form, it shows comparable affinity to mannose for both with a KD in the range of 10-7M. The dissociation constant of AQN-1G54A only differs little from the KD of the wildtyp. The mutations AQN-1G54D and AQN-1G54S show a total lost of binding activity to mannose. These results enhance the hypothesis that the CRD of spermadhesins is located around the region of the 49. to 59. aminoacid and that glycin-54 plays an important role in carbohydrate recognition.  

Beim Befruchtungsvorgang spielt die Interaktion zwischen Zellen eine entscheidende Rolle. Spermien binden zum einen an das Oviduktepithel im kaudalen Isthmus des Eileiters, um dort das Spermienreservoir zu bilden. Zum anderen binden Spermien an die Zona pellucida der Eizelle, um sie nach der Akrosomreaktion zu penetrieren und die Eizelle zu befruchten. Diese essentiellen Schritte der Zellerkennung werden durch Oligosaccharidstrukturen auf dem Epithel und der Zona pellucida und kohlenhydratbindende Proteine auf den Spermatozoen vermittelt. Den Spermadhäsinen kommt hierbei als spermienassoziierte Proteine eine besondere Bedeutung zu. Sie sind Proteine mit einer geringen relativen Molekülmasse, deren Struktur durch eine CUB-Domäne geprägt ist. Sie werden als eine neue Klasse von Lektinen bezeichnet, da sie in der Lage sind, Oligosaccharidstrukturen zu binden, aber nicht einer der bestehenden Lektin-Klassen zugeordnet werden können. Die Aufgabe dieser Arbeit bestand darin, die Kohlenhydraterkennungsdomäne (CRD Carbohydrate Recognition Domain) der Spermadhäsine näher zu charakterisieren. Mit gentechnologischen Verfahren und zielgerichteter Mutagenese wurde das porcine Spermadhäsin AQN-1 in rekombinanter und in drei mutierten Formen hergestellt und in E. coli exprimiert. Mit dem Verfahren der zielgerichteten Mutagenese konnte die Aminosäure Glycin-54 der Spermadhäsinfrequenz jeweils gegen die drei unterschiedlichen Aminosäuren Alanin, Asparaginsäure und Serin ausgetauscht werden. Glycin liegt in einem 11 Aminosäure umfassenden Sequenzmotiv im Bereich der 49.-59. Aminosäure, das bei allen kohlenhydratbindenden Spermadhäsinen durch besonders hohe Homologie geprägt ist. Nach der Reindarstellung der nativen, rekombinierten und mutierten Formen von AQN-1 wurde mit dem Modelzucker a-D-Mannose-PAA-Biotin ein Enzyme-Linked Lectin Assay (ELLA) durchgeführt. Über die Scatchard-Plot Analyse der Bindungskurven wurden die Dissoziationskonstanten (KD) ermittelt. Ein Vergleich der Bindungskonstanten, zeigt annährend gleiche Zuckerbindungseigenschaften für die native und rekombinierte AQN-1 Form mit einer KD in der Größenordnung von 10-7M. Die Dissoziationskonstante der Mutante AQN-1G54A weicht nur geringfügig von der des Wildtypes ab, so dass von einer unveränderten Zuckerbindungsfähigkeit gesprochen werden kann. Aus den Mutationen AQN-1G54D und AQN-1G54S resultiert jedoch ein vollständiger Verlust der Fähigkeit an Mannose zu binden. Diese Ergebnisse verstärken die Annahme, dass die CRD der Spermadhäsine den Bereich der 49.-59. Aminosäure umfasst und dass Glycin-54 eine signifikante Rolle bei der Kohlenhydraterkennung spielt.  

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von, Bettina: Die Kohlenhydraterkennungsdomäne der Spermadhäsinfamilie. Hannover 2002. Tierärztliche Hochschule.

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