Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchung der Bedeutung der Sialinsäure-bindenden Aktivität für die Enteropathogenität des Virus der übertragbaren Gastroenteritis der Schweine

Schwegmann-Weßels, Christel Elisabeth

TGEV is a typical member of the enteropathogenic coronaviruses. It affects pigs of all ages and causes gastroenteritis. Infection is most severe in suckling piglets with mortality rates up to 100%. The surface glycoprotein S of TGEV has two binding activities. Binding to the cellular receptor aminopeptidase N (pAPN) is required for the infection of both cultured cells and pigs. The second binding activity, the active centre of which is localized in the N-terminal region of the S protein, enables TGEV to interact with sialoglycoconjugates. Neu5Gc is the type of sialic acid preferentially recognized by TGEV. The sialic acid binding activity is dispensable for the replication in cultured cells. However, studies with mutants indicated that binding to sialoglycoconjugates is an important pathogenicity factor for the intestinal infection resulting in transmissible gastroenteritis of swine. Escherichia coli F5 binds via its fimbriae to Neu5Gc-carrying structures in the intestinal tract of suckling piglets. In this way, the bacterium can colonize the gut and cause severe diarrhea. The receptor on enterocytes has been shown to be a glycolipid, Neu5Gc-GM3, which is present only in newborn pigs. The comparison of the sialic acid binding activity of TGEV and E. coli F5 showed that the agglutination of bovine erythrocytes by these two pathogens is differentially inhibited by intestinal mucins and glycolipids. From the results it was concluded that TGEV and E. coli F5 attach to different sialylated compounds in the intestinal tract of pigs. As glycolipids could not inhibit the hemagglutination by TGEV, the subsequent search for ligands recognized by TGEV was focussed on sialoglycoproteins. TGEV was examined with respect to its interaction with cultured cells, intestinal mucins and the intestinal epithelium. The mutants HAD3 and m10 that lack a sialic acid binding activity have been used for comparison to better understand the importance of the viral sialic acid binding activity. In addition to pAPN, TGEV recognized a high molecular weight mucin-like sialoglycoprotein on the surface of ST and LLC-PK1 cells. The interaction with this protein enhanced the binding of the virions to the cell surface by a factor of 6. This was evident from the comparison with the mutants HAD3 and m10, which only bind to pAPN. For the efficient interaction with this mucin-like glycoprotein, TGEV particles had to be separated from surface-bound sialoglycoconjugates of cellular origin. The treatment of virions with neuraminidase of Vibrio cholerae unmasked the sialic acid binding sites on the S proteins of TGEV and enabled strong interaction with the high molecular weight sialoglycoprotein. TGEV was found to interact with intestinal mucins and brush border membranes of enterocytes derived from the small intestine. The mutants HAD3 and m10 did not bind to extracellular mucins and could only interact with the brush border membrane vesicles by binding to pAPN. TGEV on the other hand recognized a high molecular weight O-glycosylated sialoglycoprotein. Analysis of this protein indicated that it is a soluble mucin, which is produced in the goblet cells of the jejunum. The type, number, and steric presentation of the sialic acid residues on this mucin appear to be optimal for interaction with TGEV, because even virus not treated with neuraminidase, i.e. virions containing surface bound cellular sialoglycoproteins, are able to bind to the mucin. The differences between suckling and weaning piglets in the composition of these mucins and in their interaction with TGEV may play a role for the age-dependent progression of the gastroenteritis. The sialic acid binding activity of TGEV presents an important pathogenicity factor, which is crucial for the successful viral replication in the intestinal tract of swine. Our results indicate that the sialic acid binding activity allows the binding of virions to mucins in the intestinal mucus. This interaction may enable TGEV to stay longer in the intestinal tract, to get into contact with the epithelium, and to find the receptor pAPN on the enterocyte surface.  

Das übertragbare Gastroenteritis-Virus (TGEV) ist ein typischer Vertreter der enteropathogenen Coronaviren. Es infiziert Schweine jeden Alters. Bei Saugferkeln kommt es zu einer besonders schweren Gastroenteritis mit einer Mortalitätsrate von bis zu 100%. Auf dem Oberflächenglykoprotein S von TGEV sind zwei Bindungsaktivitäten lokalisiert. Die Bindung an den zellulären Rezeptor porzine Aminopeptidase N (pAPN) ist für die Infektion von Zellkulturen und auch im Wirtsorganismus unerlässlich. Über die zweite Bindungsaktivität, deren aktives Zentrum im N-terminalen Bereich des S-Proteins lokalisiert ist, interagiert TGEV mit den Sialinsäureresten von Glykokonjugaten, wobei Neu5Gc bevorzugt gebunden wird. Diese Sialinsäurebindungsaktivität ist zur Replikation in Zellkultur nicht notwendig. Bei der Verursachung der übertragbaren Gastroenteritis im Schwein stellt sie jedoch einen wichtigen Pathogenitätsfaktor von TGEV dar, wie vergleichende Untersuchungen mit Mutanten zeigen. Das Bakterium E. coli F5 bindet über seine Fimbrien an Neu5Gc-tragende Strukturen im Intestinaltrakt von Saugferkeln. Mit dieser Bindungsaktivität kann es den Darm kolonisieren und eine schwere Diarrhöe verursachen. Als Rezeptor auf den Enterozyten fungiert das Glykolipid Neu5Gc-GM3, welches nur bei neugeborenen Schweinen vorkommt. Der Vergleich der Sialinsäurebindungsaktivität von TGEV und E. coli F5 ergab, dass die Agglutination von Rindererythrozyten durch diese beiden Krankheitserreger von intestinalen Muzinen und Glykolipiden unterschiedlich gehemmt wird. Dieser Vergleich führte zu dem Schluss, dass TGEV und E. coli F5 auch im Darmtrakt des Schweines unterschiedliche sialinsäuretragende Strukturen zur Bindung nutzen. Da Glykolipide die Hämagglutination durch TGEV nicht messbar hemmen konnten, wurden die weiteren Untersuchungen der Bindungspartner von TGEV auf Sialoglykoproteine konzentriert. TGEV wurde hinsichtlich seiner Interaktion mit Zellkulturzellen, intestinalen Muzinen und Darmepithel untersucht. Die sialinsäurebindungsdefizienten Mutanten HAD3 und m10 (stark reduzierte Enteropathogenität) wurden bei diesen Untersuchungen vergleichend eingesetzt, um die Bedeutung der Sialinsäure-bindenden Aktivität von TGEV besser verstehen zu können. TGEV erkannte zusätzlich zu pAPN ein hochmolekulares muzinartiges Sialoglykoprotein auf der Oberfläche von ST- und LLC-PK1-Zellen. Die Bindung der Virionen an die Zelloberfläche war durch die Interaktion von TGEV mit diesem Protein um ca. das Sechsfache erhöht. Dies ließ der Vergleich mit den Mutanten HAD3 und m10 erkennen, die mangels Sialinsäurebindungsaktivität nur an pAPN binden konnten. Um mit diesem muzinartigen Protein interagieren zu können, mussten die TGEV-Partikel jedoch von auf der Oberfläche haftenden Sialoglykokonjugaten zellulären Ursprungs befreit werden. Durch die Behandlung mit Neuraminidase aus Vibrio cholerae konnten die Sialinsäurebindungsstellen auf den S-Proteinen von TGEV demaskiert und die Interaktion mit dem hochmolekularen Sialoglykoprotein möglich gemacht werden. TGEV konnte mit intestinalen Muzinen und Bürstensaummembranen der Enterozyten des Dünndarms interagieren. Die sialinsäurebindungsdefizienten Mutanten HAD3 und m10 banden nicht an die extrazellulären Muzine und konnten nur über die Bindung an pAPN mit den Bürstensaummembranvesikeln (BSMV) interagieren. TGEV hingegen erkannte über seine Sialinsäurebindungsaktivität zusätzlich ein hochmolekulares O-glykosyliertes Sialoglykoprotein. Die Untersuchungen zu diesem Protein weisen darauf hin, dass es sich um ein lösliches Muzin handelt, welches in den Becherzellen des Jejunums produziert wird. Dieses Muzin präsentiert die Sialinsäurereste in optimaler Form für TGEV, so dass selbst unbehandeltes, d.h. mit zellulären Sialoglykokonjugaten beladenes Virus an das Muzin bindet. Die Unterschiede zwischen Saug- und Absetzferkeln in der Zusammensetzung dieser Muzine und in der Interaktion mit TGEV könnten eine Rolle für den altersabhängigen Verlauf der Gastroenteritis spielen. Die Sialinsäurebindungsaktivität von TGEV stellt einen wichtigen Pathogenitätsfaktor dar, der für die erfolgreiche Virusreplikation im Intestinaltrakt von Schweinen von entscheidender Bedeutung ist. Die Funktion der Sialinsäure-bindenden Aktivität scheint darin zu bestehen, dass die Bindung von Virionen an Muzine im Darmschleim ermöglicht und damit die Wahrscheinlichkeit, zum Rezeptor pAPN auf der Enterozytenoberfläche gelangen zu können, deutlich erhöht wird.  

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Schwegmann-Weßels, Christel Elisabeth: Untersuchung der Bedeutung der Sialinsäure-bindenden Aktivität für die Enteropathogenität des Virus der übertragbaren Gastroenteritis der Schweine. Hannover 2002. Tierärztliche Hochschule.

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