Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Der isoliert hämoperfundierte Rinderuterus als In-vitro-Modell zur Prüfung antiinflammatorischer Substanzen

Braun, Michael Heinrich Willi

A modified model of the isolated perfused bovine uterus was established and its suitability as in vitro model for the evaluation of antiinflammatory drugs was tested. The uteri were obtained from healthy slaughter cattle and perfused with a mixture of 80 % bovine blood and 20 % tyrode solution. The perfusion medium was oxygenated via a dialysis system. By measuring the glucose consumption, the lactate production and calculating the lactate-glucose-ratio could be demonstrated, that the use of blood as perfusion medium assures a viability of the organs over a period of five hours. These results are comparable to the isolated tyrode perfused bovine uterus. Local administration of arachidonic acid (5 mg) induced a mainly COX-1 mediated inflammation which is characterised by a significant increase in tissue PGE2 concentration. In contrast, there was no difference observed in PGE2 synthesis after local administration of carrageenin (2 %) and LPS (0.2 mg), although both induce a preferential COX-2-mediated inflammation in commonly used animal models. Additionally, no changes in mRNA levels in treated and non-treated myometrium were observed, although transcripts of both COX-isoforms were detected. To elucidate the differences between the own results and data reported from in vivo studies, the influence of the hemoperfusion on inflammatory reactions of the uterus was investigated. RT-PCR analysis indicated that post-ischemic hemoperfusion provides a distinct proinflammatory stimulus. This was demonstrated by an upregulation of mRNA levels of both COX-2 and iNOS in perfused tissue in comparison to non-perfused tissue. Although COX-2-protein was present in non-perfused tissue no changes in protein levels were observed throughout the perfusion period. The results of RT-PCR analysis were confirmed by determination of a distinct rise in PGE2-concentration in both non-treated and arachidonic acid- and arachidonoyl ethanolamide-treated tissue. These data indicate that an acute inflammatory reaction is in-duced in the isolated hemoperfused bovine uterus, which can be attributed to an ischemia-reperfusion-injury. Following these studies, the influence of the perfusion with the NSAID flunixin (1 µg/ml), the COX-2-selective inhibitor DFU (0.36 µg/ml) and the glucocorticoid dexamethasone (0.1 µg/ml) on the inflammation was investigated. In order to assess the COX-specifity of the test substances, a preferential COX-2-mediated PGE2 production was induced by local administration of arachidonoyl ethanolamide and low dose arachidonic acid (0.1 mg). All test substances induced a significant inhibition of PGE2 synthesis compared with control uteri. Flunixin was the most effective substance tested. None of the substances induced changes in COX-2 mRNA levels, whereas dexamethasone and flunixin evoked a measurable downregulation of iNOS transcripts after five hours. In accordance with the results of the RT-PCR analysis dexamethasone showed no influence on COX-2 protein. With regard to a cyclooxygenase-mediated acute inflammatory process in the myometrium of the isolated hemoperfused bovine uterus and its pharmacological modulation, the own results are comparable with the data provided by various animal models of inflammation. The model seems to be suitable to estimate the COX-specifity of test substances and may therefore contribute to the reduction of animal testing.

In der vorliegenden Arbeit wurde ein modifiziertes Modell des isoliert perfundierten Rinderuterus etabliert und dessen Einsatz als In-vitro-Modell zur Evaluierung antiinflammatorischer Substanzen  getestet. Hierfür wurden Uteri von gesunden Schlachtkühen mit einem Gemisch aus 80 % Rinderblut und 20 % Tyrode-Lösung perfundiert, welches über ein Dialysesystem oxygeniert wurde. Durch die Bestimmung des Glucoseverbrauchs, der Lactatproduktion und des Lactat-Glucose-Verhältnisses konnte gezeigt werden, daß unter Verwendung von Blut als Perfusionsmedium eine mit dem isoliert tyrode-perfundierten Rinderuterus vergleichbare Vitalität der Organe für einen Zeitraum von fünf Stunden gewährleistet werden kann. Eine lokale Applikation von Arachidonsäure (5 mg) führte eine überwiegend COX-1-mediierte Entzündung mit einem signifikanten Anstieg der PGE2-Konzentration im Gewebe herbei. Im Gegensatz dazu wurde durch die lokale Applikation von Carrageenin (2 %) und LPS (0,2 mg), die in bewährten Tiermodellen zur Auslösung einer präferenziell COX-2-mediierten Entzündung verwendet werden, keine Veränderung der PGE2-Synthese im Vergleich zu unbehandeltem Gewebe ausgelöst. Auch auf mRNA-Ebene waren keine Unterschiede zwischen behandeltem und unbehandeltem Myometrium vorhanden, obwohl Transkripte für beide Isoformen der COX nachweisbar waren. Um den Grund für diese Diskrepanz zwischen den eigenen Ergebnissen und Daten aus In-vivo-Studien zu eruieren, wurde der Einfluß der Hämoperfusion auf das Entzündungsgeschehen im Uterus untersucht. Die Bestimmung der mRNA erbrachte den eindeutigen Hinweis, daß durch die Hämoperfusion nach Ischämie ein massiver proinflammatorischer Stimulus gesetzt wird, da eine deutliche Hochregulation der COX-2 und der iNOS im Vergleich zum nicht perfundierten Gewebe beobachtet werden konnte. Im Gegensatz dazu war keine Veränderung des COX-2-Proteins zu verzeichnen, wobei das Enzym jedoch bereits in der Nullkontrolle nachweisbar war. Die parallel durchgeführte Messung des PGE2-Gehalts in unbehandeltem und arachidonsäure- und arachidonoylethanolamidbehandeltem Gewebe ergab einen deutlichen Anstieg in allen Proben und bestätigte somit das Ergebnis aus der RT-PCR. Zusammenfassend weisen diese Daten darauf hin, daß im isoliert hämoperfundierten Rinderuterus ein akutes Entzündungsgeschehen ausgelöst wird, dessen Entstehung wahrscheinlich auf eine Ischämie-Reperfusions-Schädigung zurückzuführen ist. Anschließend wurde der Einfluß des NSAID Flunixin (1 µg/ml), des spezifischen COX-2-Inhibitors DFU (0,36 µg/ml) und des Glucocorticoids Dexamethason (0,1 µg/ml), welche zum Pefusionsmedium gegeben wurden, untersucht. Die Verwendung von Arachidonoylethanolamid und einer niedrigen Dosis Arachidonsäure (0,1 mg) diente dem Zweck, eine überwiegend COX-2-mediierte PGE2-Produktion zu induzieren, um die COX-Spezifität der Testsubstanzen zu beurteilen. Alle Testsubstanzen führten zu einer signifikanten Hemmung der PGE2-Synthese im Vergleich zu Kontrolluteri, wobei Flunixin am effektivsten war. Keine der Substanzen zeigte eine Beeinflussung der COX-2 auf mRNA-Ebene, jedoch führten Flunixin und Dexamethason zu einer nach fünf Stunden meßbaren Reduktion des Transkripts der iNOS. Auf Proteinebene zeigte Dexamethason analog zu den Ergebnissen der RT-PCR keine Wirkung. Die Ergebnisse bezüglich eines Cyclooxygenase-mediierten akuten Entzündungsgeschehens im Myometrium des isoliert hämoperfundierten Rinderuterus und dessen pharmakologische Beeinflussung sind mit den Ergebnissen aus anderen Entzündungsmodellen (in vivo) vergleichbar. Das Modell erscheint geeignet, eine Aussage über die COX-Spezifität von Testsubstanzen zu treffen, weshalb der isoliert hämoperfundierte Rinderuterus einen Beitrag zur Reduzierung von Tierversuchen leisten kann.

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Braun, Michael Heinrich Willi: Der isoliert hämoperfundierte Rinderuterus als In-vitro-Modell zur Prüfung antiinflammatorischer Substanzen. Hannover 2002. Tierärztliche Hochschule.

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