Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Expression der Ca2+-Kanäle ECaC1 und ECaC2 im Dünndarm von Saug- und Absetzferkeln

Hinterding, Thomas

Functional data from postnatal development of the intestinal Ca2+-absorption in pigs were collected and the Ca2+-channels which are responsible for the Ca2+-uptake across the brush border membrane of enterocytes were investigated qualitatively and age-dependent quantitatively. To collect the functional data brush border membrane vesicles were prepared from enterocytes of the proximal small intestine of suckling and weaned piglets as well as porkers by combined Mg2+-precipitation method and differential centrifugation and the Ca2+-uptakes were investigated by the rapid filtration technique using the radiotracer 45Ca. Epithelial Ca2+-channels (ECaC) were identified with RT-PCR using primers deduced from well known sequences of other species. For the relative quantification of ECaC on mRNA levels investigations were carried out with preparations of suckling and weaned piglets by northern blots and real-time-PCRs.     Following results are to be emphasised:   (1)   (1)   The kinetic of the Ca2+-uptake into the duodenal brush border membrane vesicles could be fitted best with a “one-site-binding” model. The results did not support directly the assumption of the presence of different ECaCs in the small intestine of pigs.   (2)   (2)   Suckling piglets had a significantly higher maximal Ca2+-uptake (Vmax) compared with weaned piglets (p < 0.01) or porkers (p < 0.05). Vmax values were 3.64 ± 0.45 nmol.mg-1 protein.30s-1 in suckling piglets, 1.89 ± 0.20 nmol.mg-1 protein.30s-1 in weaned piglets and 2.13 ± 0.20 nmol.mg-1 protein.30s-1 in porkers (± SEM, n = 5).   (3)   (3)   Suckling piglets had a significantly higher apparent Km compared with weaned piglets or porkers (p < 0.05). Km values were 1.44 ± 0.06 mmol.l-1 in suckling piglets, 1.14 ± 0.05 mmol.l-1 in weaned piglets and 1.13 ± 0.09 mmol.l-1 in porkers (± SEM, n = 5).   (4)   (4)   Partial sequences from the Ca2+-channels were detected which show to some extent sequence overlay. That can be analysed as an evidence for the presence of two different Ca2+-channels in porcine duodenum. One of the partial sequences had a higher homology to the ECaC1 of rat (95 %) compared with ECaC2 of human (33 %). The other partial sequence exhibited a higher homology to the hECaC2 (88 %) compared with the rECaC1 (81 %).   (5)   (5)   With the real-time-PCR method differentiation of ECaC1 and ECaC2 was enabled. The mRNA for ECaC1 was present in suckling and weaned piglets in rather small extent but without a difference. The mRNA level for ECaC2 was lower by 66 % in suckling piglets compared with weaned piglets.   In summary, the results show that two different Ca2+-channels are involved in Ca2+-absorption from the small intestines, similarly to those shown recently in other mammalian species. The mRNA levels of these channels can be quantified using the  real-time-PCR method and the results for the ECaC2 point to same kind of postnatal adaptation, which should be further elucidated in following investigations.  

Es wurden funktionelle Daten zur postnatalen Entwicklung des intestinalen Ca2+-Transportes bei Schweinen erhoben und anschließend mit molekularbiologischen Methoden diejenigen Ca2+-Kanäle, die für die Aufnahme von Ca2+ durch die Bürstensaummembran der Enterozyten verantwortlich sind, qualitativ und altersabhängig quantitativ untersucht. Zur Erfassung der funktionellen Daten wurden Bürstensaummembranvesikel von Enterozyten aus dem vorderen Dünndarm von Saug-, Absetz- und Mastferkeln mittels Mg2+-Präzipitation und Differentialzentrifugation hergestellt und die Ca2+-Aufnahmeraten mittels Schnellfiltrationstechnik unter Verwendung des Radiotracers 45Ca untersucht. Der qualitative Nachweis der epithelialen Ca2+-Kanäle (ECaC) erfolgte mit der RT-PCR und Primern in Anlehnung an bekannte Sequenzen anderer Spezies. Zur relativen Quantifizierung der ECaC auf mRNA-Ebene wurden Untersuchungen bei Saug- und Absetzferkeln mit Hilfe von Northern-Blots und Real-Time-PCRs durchgeführt.     Die Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen:   (1)   (1)   Die Kinetik der Ca2+-Aufnahme in duodenale BSMV des Ferkels konnte am Besten mit einem „One-site-binding“-Modell angepasst werden. Die daraus erhaltenen kinetischen Daten ergaben keinen unmittelbaren Hinweis für die Präsenz verschiedener ECaC im Schweinedünndarm.   (2)   (2)   Saugferkel hatten eine signifikant höhere maximale Ca2+-Aufnahmerate (Vmax) als Absetzferkel (p < 0,01) oder Mastferkel (p < 0,05). Die Vmax-Werte der Saugferkel betrugen 3,64 ± 0,45 nmol.mg-1 Protein.30s-1, die der Absetzferkel 1,89 ± 0,20 nmol.mg-1 Protein.30s-1 und die der Mastferkel 2,13 ± 0,20 nmol.mg-1 Protein.30s-1 (± SEM, n = 5).   (3)   (3)   Saugferkel wiesen eine signifikant höhere apparente Km auf als Absetzferkel oder Mastferkel (p < 0,05). Die Km-Werte der Saugferkel betrugen 1,44 ± 0,06 mmol.l-1 , die der Absetzferkel 1,14 ± 0,05 mmol.l-1 und die der Mastferkel 1,13 ± 0,09 mmol.l-1 ( ± SEM, n = 5).   (4)   (4)   Es wurden Teilsequenzen von Ca2+-Kanälen ermittelt, die sich teilweise überlagerten, was auf die Präsenz zweier verschiedener Ca2+-Kanäle hinweist. Eine dieser Teilsequenzen hatte eine deutlich höhere Homologie zum ECaC1 der Ratte (95 %) als zum ECaC2 des Menschen (33 %). Die andere Teilsequenz wies eine höhere Homologie zum ECaC2 des Menschen (88 %) als zum ECaC1 der Ratte auf (81 %).   (5)   (5)   Mit der Real-Time-PCR-Methode konnte zwischen ECaC1 und ECaC2 differenziert werden. Die mRNA für den ECaC1 war bei Saug- und Absetzferkeln in sehr geringem Umfang vorhanden, der aber nicht unterschiedlich war. Ein Unterschied in Abhängigkeit des Alters konnte nicht festgestellt werden. Der mRNA-Gehalt für den ECaC2 war beim Saugferkel gegenüber dem Absetzferkel um 2/3 erniedrigt.   Die Ergebnisse zeigen, dass wie bei anderen bislang untersuchten Säugerspezies auch beim Schwein zwei verschiedene Ca2+-Kanäle am intestinalen Ca2+-Transport beteiligt sind. Der mRNA-Gehalt dieser Kanäle lässt sich über die Real-Time-PCR quantifizieren und zeigt für den ECaC2 einen altersabhängigen Effekt.  

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Hinterding, Thomas: Expression der Ca2+-Kanäle ECaC1 und ECaC2 im Dünndarm von Saug- und Absetzferkeln. Hannover 2002. Tierärztliche Hochschule.

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